镇肝熄风汤对帕金森病肝阳上亢证大鼠旋转行为的影响＊

李晓明，张丽华，綦艳秋，孙 影，朱兰芹，董妙先＊＊

（1.齐齐哈尔医学院医药科学研究所 齐齐哈尔 161006；2. 齐齐哈尔医学院卫生所 齐齐哈尔 161006）

镇肝熄风汤对帕金森病肝阳上亢证大鼠旋转行为的影响＊

李晓明1，张丽华2，綦艳秋2，孙 影2，朱兰芹2，董妙先2＊＊

（1.齐齐哈尔医学院医药科学研究所 齐齐哈尔 161006；2. 齐齐哈尔医学院卫生所 齐齐哈尔 161006）

目的：观察镇肝熄风汤对帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）肝阳上亢证模型大鼠旋转行为的影响，探讨其可能的作用机制。方法：采用附子汤灌胃联合6-OHDA偏侧毁损制备PD肝阳上亢证大鼠模型，肝熄风汤灌胃给药28天。观察阿朴吗啡诱导的大鼠旋转行为，采用实时荧光定量PCR检测编码核因子E2相关因子2（Transcription Factor NF-E2-Related Factor 2，Nrf2）基因Nfe2l2和编码血红素加氧酶-1（Heme Oxygenase 1，HO-1）的基因Hmox-1的表达，采用Western blot检测Keap1蛋白表达。结果：与模型组比较，镇肝熄风汤显著减少了阿朴吗啡诱导的PD大鼠旋转行为，上调了模型大鼠中脑黑质Nfe2l2和Hmox-1 mRNA表达，抑制了Keap1蛋白表达。与假手术组比较，模型组大鼠中脑黑质Nfe2l2和Hmox-1 mRNA的代偿性增加也达到了统计学意义，但Keap1蛋白表达无显著性改变。结论：镇肝熄风汤可改善PD肝阳上亢证大鼠的行为学改变，增加中脑黑质Nfe2l2和Hmox-1 mRNA表达，抑制了Keap1蛋白表达，提示镇肝熄风汤抗PD的作用可能与其抗氧化作用有关。

镇肝熄风汤 旋转行为 核因子E2相关因子2 肝阳上亢证 帕金森病

PD是一种常见的神经退行性疾病，临床症状主要为静止性震颤、肌肉僵直、运动徐缓和姿势步态异常。目前普遍认为PD的发病与多种致病因素有关，其中脑组织脂质过氧化促进黑质多巴胺（Dopamine，DA）能神经元的变性是主要原因[1]。镇肝熄风汤出自清代名医张锡纯的《医学衷中参西录》，功用镇肝熄风，滋阴潜阳，是治疗肝阳化风证的经典方。近年来，临床应用该方治疗PD患者，对改善症状取得良好的临床疗效[2]，但其抗PD作用的机制尚未完全阐明。本研究采用附子汤灌胃联合6-羟基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）偏侧毁损制备PD肝阳上亢证大鼠模型，观察镇肝熄风汤对PD肝阳上亢证大鼠旋转行为的改善作用，探讨其可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠105只，体质量220-240 g。由维通利华（北京）实验动物科技有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 药物

镇肝熄风汤由怀牛膝（批号：130501）：代赭石（批号：30301）：生龙骨（批号：130501）：生牡蛎（批号：140301）：生龟板（批号：140701）：生白芍（批号：130401）：元参（批号：130601）：天冬（批号：13110）：川楝子（批号：140301）：生麦芽（批号：130501）：茵陈（批号：130201）：甘草（批号：130601）比例为60：60：30：30：30：30：30：30：12：12：12：9组 成。 水 煎2次后合并煎液，过滤浓缩（含生药3.0 g·mL-1），饮片均购自哈尔滨市盛泰中药饮片加工厂。附子汤由单味制附子组成，附子（批号：D4120201）购自黄冈金贵中药产业发展有限公司。其他药物有：盐酸司来吉兰片（成都蓉药集团四川长威制药有限公司，批号：20130902）、6-OHDA（美国Santa Cruz公司，批号：D2312）、Apomorphine（美国Cayman公司，批号：0458853-17）。

1.1.3 试剂

PrimeScript™ RT Reagent kit（TaKaRa宝生物工程大连有限公司，批号：BK4001）、SYBR®Premix Ex Taq™（TakaRa宝生物工程大连有限公司，批号：AK2603），TRIzol®Reagent（批 号：47323） 购自Ambion公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列为：Nfe2l2 上游引物5'-CCCAGCACATCCAGACAGAC-3'，下 游 引 物5'-TATCCAGGGCAAGCGACTC-3'；Hmox-1上 游引物5'-TGCTCGCATGAACACTCTG-3'，下游引物5'-TCCTCTGTCAGCAGTGCCT-3'；Gapdh上游引物5'-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3'，下游引物R5'-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3'。细胞浆蛋白与核蛋白抽提试剂盒（南通碧云天公司，批号：P0028），显光剂（美国Thermo公司，批号：PH203837），GAPDH抗体（美国Cell signaling公司，批号：8），Keap1抗体（美国Santa Cruz公司，批号：F2615），山羊二抗（北京康为世纪生物科技有限公司，批号：00161506）。

1.1.4 仪器

Stratagene Mx3005P实时荧光定量PCR仪（美国Agilent公司，型号：Mx3005P），S1000™ Thermal Cycler（美国BIO-RAD公司，型号：S1000），江湾Ⅰ型C立体定向仪（第二军医大学，型号：I型C），微量进样器（上海高鸽工贸有限公司），XPE504精密分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型号：XPE504），ELX800全自动酶标仪（美国BioTek公司，型号：ELX800），DXP-2大小鼠转棒仪（医科院药研所，型号：DXP-2）。电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY-ZY2、JY-CZ1），Smart Chemi™Image Analysis System（北京赛智创业科技有限公司，型号：SmartChemi 500）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、造模及给药

大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、司来吉兰组、镇肝熄风汤低、中、高剂量组。制备PD肝阳上亢证大鼠病证结合模型：每天给予大鼠附子汤（2 g·kg-1）灌胃4周之后，1%的戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位固定于脑立体定位仪上。切开颅部皮肤，参照Paxions大鼠脑立体定位图谱中黑质组织的位置，在前囟后5.2 mm，矢状缝右侧 1.8 mm，硬膜下7.6 mm；采用微量进样器注射6-OHDA溶液2 μL（4 μg·μL-1）后缝合皮肤，假手术组注射等量生理盐水溶液。司来吉兰组每天给予剂量为0.9 mg·kg-1、镇肝熄风汤低剂量组每天给予剂量为8 g·kg-1、镇肝熄风汤中剂量组每天给予剂量为16 g·kg-1、镇肝熄风汤高剂量组每天给予剂量为32 g·kg-1，每组大鼠连续灌胃给药28天。正常对照组、假手术组和模型组大鼠给予生理盐水灌胃。

1.2.2 大鼠平衡能力检测

将大鼠置于旋转的转棒仪上，检测从转棒跌落下来的时间（即运动潜伏期）。

1.2.3 阿朴吗啡诱导的旋转行为评价

大鼠腹腔内注射阿朴吗啡（0.5 mg·kg-1）10 min后，开始观察并记录大鼠的旋转行为，表现为以对侧的前肢或后肢为支撑点，向损伤对侧旋转，头尾相接，身体弯曲成环状的快速旋转行为，共记录30 min。

1.2.4 Real-time PCR检测Nfe2l2和Hmox-1 mRNA表达

取大鼠中脑黑质组织，采用TRIzol®Reagent法提取总RNA。cDNA的合成按照PrimeScript™ RT试剂盒说明书进行，采用SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒分析Ct值，以2-ΔΔCt方法计算Nfe2l2和Hmox-1 mRNA相对表达量。

1.2.5 Western blot法检测核Keap1蛋白表达

在冰上取大鼠中脑黑质组织，采用蛋白抽提试剂盒提取浆蛋白。蛋白经SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭后，加入Keap1抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入辣根过氧化酶标记的二抗，孵育，洗膜，用ECL法显光后采用Smart Chemi™ Image Analysis System进行分析。

1.2.6 统计学方法

2 结果

2.1 镇肝熄风汤改善PD肝阳上亢证模型大鼠运动行为损伤

大鼠平衡能力检测和阿朴吗啡诱导的旋转行为评价结果显示，与假手术组比较，PD肝阳上亢证模型组大鼠运动潜伏期显著减少，而30 min旋转次数显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，镇肝熄风汤高、中、低剂量组和司来吉兰组大鼠运动潜伏期显著增加，而30 min旋转次数显著减少（P＜0.05）。与司来吉兰组比较，高剂量镇肝熄风汤组大鼠运动潜伏期和旋转次数差异均无统计学意义（P＞0.05）。镇肝熄风汤对PD肝阳上亢证模型大鼠运动行为损伤的影响见图1。

2.2 镇肝熄风汤上调了PD肝阳上亢证模型大鼠中脑黑质Nfe2l2 mRNA表达

PCR结果显示，与假手术组比较，PD肝阳上亢证模型组大鼠中脑黑质Nfe2l2 mRNA表达代偿性增加（P＜0.05）。与模型组比较，镇肝熄风汤低、中、高剂量组大鼠中脑黑质Nfe2l2 mRNA表达均显著性增加（P＜0.05）。司来吉兰对PD肝阳上亢证模型大鼠中脑黑质Nfe2l2 mRNA表达无显著性影响（P＞0.05）。镇肝熄风汤对PD肝阳上亢证模型大鼠中脑黑质Nfe2l2 mRNA表达的影响见图2。

2.3 镇肝熄风汤诱导了PD肝阳上亢证模型大鼠中脑黑质Hmox-1 mRNA表达

PCR结果显示，与假手术组比较，PD肝阳上亢证模型组大鼠中脑黑质Hmox-1 mRNA表达代偿性增加（P＜0.05）。与模型组比较，镇肝熄风汤低、中、高剂量组大鼠中脑黑质Hmox-1 mRNA表达均显著性增加（P＜0.05）。司来吉兰对PD肝阳上亢证模型大鼠中脑黑质Hmox-1 mRNA表达无显著性影响（P＞0.05）。镇肝熄风汤对PD肝阳上亢证模型大鼠中脑黑质Hmox-1 mRNA表达的影响见图2。

2.4 镇肝熄风汤抑制了PD肝阳上亢证模型大鼠中脑黑质Keap1蛋白表达

Western blot显示，与假手术组比较，PD肝阳上亢证模型组大鼠中脑黑质Keap1蛋白表达无显著性变化（P＞0.05）。与模型组比较，低、中、高剂量镇肝熄风汤组大鼠中脑黑质Keap1蛋白表达均显著性降低（P＜0.05）。司来吉兰对PD肝阳上亢证模型大鼠中脑黑质Keap1蛋白表达无显著性影响（P＞0.05）。镇肝熄风汤对PD肝阳上亢证模型大鼠中脑黑质Keap1蛋白表达的影响见图3。

图1 各组大鼠运动行为损伤的比较

3 讨论

附子为辛、甘、大热之品，灌服附子汤能灼伤大鼠的肝肾之阴而导致其肝阳上亢。本文采用在肝阳上亢证候模型基础上再施加6-OHDA单侧损毁PD模型诱导因素，通过该复合因素法建立的模型能较好地体现“病”与“证”各方面的特征。本文观察到附子汤灌胃联合6-OHDA偏侧毁损制备帕金森病肝阳上亢证模型大鼠的易激惹程度（“狂躁易怒”症状）和结膜充血（“目赤”症状）显著增加，与人类肝阳上亢证临床表现相近似。PD肝阳上亢证大鼠在阿朴吗啡诱导后出现明显的旋转行为，与PD患者的行为学相似，因此，本文认为附子汤灌胃联合6-OHDA偏侧毁损制备PD肝阳上亢证动物模型是可行的。

6-OHDA是一种亲神经毒性物质，可被DA能神经元主动摄取到细胞内，经氧化生成羟自由基和醌类等神经毒性物质，特异性破坏含DA的神经细胞，导致PD样改变，6-OHDA成为公认的制备PD动物模型的神经毒[3]。阿朴吗啡是外源性DA受体激动剂，能诱导PD模型大鼠的旋转行为[4]。通过观察阿朴吗啡诱导的旋转次数，可以对PD的损伤程度进行量化，作为评价药物治疗作用的指标之一[5]。本实验结果表明，PD肝阳上亢证大鼠在阿朴吗啡诱导后出现明显的旋转行为，镇肝熄风汤干预4周后，则能显著改善PD大鼠的行为异常，从而推测镇肝熄风汤对DA神经元具有一定保护作用。

图2 各组大鼠中脑黑质Nfe2l2和Hmox-1 mRNA表达的差异。

图3 各组大鼠中脑黑质Keap1蛋白表达的变化

血红素氧合酶是一种广泛存在的抗氧化防御酶，HO-1属微粒体酶，是诱导型的血红素加氧酶，凡引起细胞活性氧类水平增加的外来刺激，如：MPP+和6-OHDA，大都能使HO-1的表达增加[6,7]。作为可诱导应激蛋白，HO-1已被广泛认为是氧化应激中一种高度敏感和可靠的指标[8]。PD是一种多病因导致的老年退行性疾病，目前认为氧化应激是PD发病的核心因素，抗氧化治疗是治疗PD有效的方案之一[9]。正常生物体内存在着HO-1等抗氧化酶，通过抗氧化以及清除多余的自由基对机体起保护作用[10]。

6-OHDA引起神经损伤的主要原因是毒素引起的氧化应激，氧化应激能够破坏脂质、蛋白质和DNA，导致细胞死亡[11]。研究表明，使用中药及其活性成分作为诱导剂，产生内源性抗氧化剂和Ⅱ相抗氧化解毒酶是防止DA神经元氧化应激的一个重要策略[12]。本实验结果表明，6-OHDA诱导的PD大鼠中脑黑质Hmox-1 mRNA代偿性增加，而镇肝熄风汤干预显著的提高了大鼠中脑黑质Hmox-1 mRNA表达，表明镇肝熄风汤能提高PD肝阳上亢证模型大鼠的抗氧化能力。

通过激活细胞的内源性抗氧化系统来改善氧化损伤，近年来倍受国内外学者关注[13]。Nrf2通过激活抗氧化反应元件，启动细胞内的抗氧化通路，清除活性氧，被认为是调控多种抗氧化酶转录表达的关键内源性通路[14]，Nrf2是调控HO-1表达的关键上游转录因子[15]。Nrf2敲除的小鼠神经元更易受MPTP损伤[16]。药理学途径激活Nrf2可以在体内或体外抑制6-OHDA、MPP+以及MPTP引起的神经元损伤[17-19]。在PD发病过程中，DA神经元中Nrf2的表达上调，这可能是神经元对氧化应激的代偿性反应[20]。本文发现，PD肝阳上亢证模型组大鼠中脑黑质Nfe2l2 mRNA表达代偿性增加。肝熄风汤组大鼠中脑黑质Nfe2l2 mRNA表达进一步显著性增加。同时，肝熄风汤组大鼠中脑黑质Keap1蛋白质表达显著降低，进一步促进了Nfe2l2核转位。

综上所述，镇肝熄风汤可能通过上调PD肝阳上亢证大鼠中脑黑质核Nfe2l2表达和抑制Keap1蛋白表达，诱导Hmox-1转录，抑制PD肝阳上亢证模型大鼠中脑黑质氧化应激，进而改善运动行为损伤。

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Abstract:The aim of this study was to explore the effects of ZGXF decoction on amphetamine-induced rotation in PD rats with syndrome of liver-yang hyperactivity, and its mechanism involved. Rats received 6-OHDA administration via intra-substantia nigra injection and were intragastrically treated by Fu Zi decoction to establish the PD model with the syndrome of liver-yang hyperactivity. Three doses of ZGXF decoction or selegiline were given by a 28-day intragastric administration. The rats were tested for amphetamine-induced rotation asymmetry. In addition, real-time PCR were adopted to analyze the expressions of Nfe2l2 and Hmox-1 mRNAs, while western blot to analyze the expression of Keap1 protein. As a result, it was found that ZGXF decoction dose-dependently attenuated amphetamine-induced rotation, up-regulated the expressions of Nfe2l2 and Hmox-1 mRNAs, and down-regulated the expression of Keap1 protein in the substantia nigra in PD rats with syndrome of liver-yang hyperactivity. It was suggested that anti-PD effects of ZGXF decoction be attributed to the up-regulation of Nfe2l2 and Hmox-1 mRNAs and the down-regulation of Keap1 protein, being associated with oxidative stress, in the substantia nigra of PD rats with syndrome of liver- yang hyperactivity.

Effects of Zhen Gan Xi Feng (ZGXF) Decoction on Amphetamine-Induced Rotation in Rats with Parkinson’s Disease (PD) with the Syndrome of Liver-Yang Hyperactivity

Li Xiaoming1, Zhang Lihua2, Qi Yanqiu2, Sun Ying2, Zhu Lanqin2, Dong Miaoxian2
(1. The Institute of Medicine, Qiqihar Medical Univeristy, Qiqihar 161006, China;2. Health Center, Qiqihar Medical Univeristy, Qiqihar 161006, China)

Zhen Gan Xi Feng decoction, rotation behavior, transcription factor NF-e2-related factor 2, syndrome of liver-yang hyperactivity, Parkinson's disease

10.11842/wst.2016.12.019

R2-031

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-09-21

修回日期：2016-11-04

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81373629）：基于PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的镇肝熄风法抑制帕金森病氧化应激损伤的机制研究，负责人：董妙先。

＊＊ 通讯作者：董妙先，主任医师，主要研究方向：中药药理学研究。