响应面法优化龙葵皂苷类成分的提取工艺

吴 伟，张 云，向 福(1.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄州 438000； .湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003； 3.黄冈师范学院 生命科学学院，湖北 黄州 438000)

响应面法优化龙葵皂苷类成分的提取工艺

吴 伟1,2，张 云2，向 福1,3*
(1.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄州 438000； 2.湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003； 3.黄冈师范学院 生命科学学院，湖北 黄州 438000)

为了探讨龙葵皂苷类成分最佳提取工艺，科学开发利用大别山区龙葵资源，采用单因素试验优化乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比和提取次数等关键影响因素，并以龙葵皂苷提取率为响应值设计响应面优化试验优化大别山龙葵中皂苷类成分的提取工艺。结果表明，最佳提取条件为：乙醇体积分数88%，提取时间4.5 h，料液比1∶15(g/mL)，提取温度70 ℃，提取次数3次。在此条件下进行3次验证试验，龙葵皂苷提取率的平均值为2.489 8%，与回归方程得出的理论数值2.505 3%基本相符。

龙葵； 皂苷； 提取； 响应面分析

大别山区独特的地理位置和良好的气候环境使其自古以来都是药材资源基地，也是全国的中药材重点产区之一。其中，地处大别山区的罗田县中药资源尤其丰富。龙葵为茄科1年生草本植物，在罗田县分布较为广泛，其干燥地上部分可入药，在传统的中医药中，龙葵主要与其他中药配伍用于各种肿瘤的治疗[1]。据文献报道，龙葵合剂对于原发性肝癌[2-4]、晚期胃癌[5]、肺癌[6-7]等癌症具有确切的疗效。此外，龙葵还用于治疗慢性前列腺炎[8-10]、高血压[11]、支气管炎[12]、血尿[13-14]、功血和崩漏[15-16]等疾病。龙葵中含有多种药用成分，例如甾体皂苷类化合物、黄酮类化合物、多糖及维生素等，尤其甾体皂苷类化合物具有较强的抗肿瘤活性，对人体肝细胞株FHCC-98显示了较强的细胞毒性，是龙葵的主要功效成分之一[17]，具有极高的药用价值以及开发潜力。

响应面法是试验设计、数理统计和最优化技术的一种综合应用，是数学方法和统计方法结合的产物，可以用来对所感兴趣的响应值受多个变量影响的问题进行建模和分析，从而最终优化该响应值[18]。近年来，由于统计学在各个领域的发展和应用，响应面法的应用领域不断拓宽，其应用不再局限于化学工业，在生物医药领域都得以广泛应用[19]。本研究以总皂苷量为评价指标，采用响应面分析法对龙葵总皂苷的提取工艺进行优化，为在大别山区实现其产业化及综合利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料龙葵草采自湖北省罗田县。

1.2 仪器与试剂

主要仪器：YP6002电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)、DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海姚氏仪器设备厂)、RE-3000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、SHZ-Ⅲ循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)、SF-130C万能粉碎机(吉首市中诚制药机械厂)、752SP紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)、HWS26水浴锅(上海一恒科技有限公司)。

主要试剂：无水乙醇(分析纯，武汉市洪山中南化工试剂有限责任公司)、薯蓣皂苷(色谱纯，中国药品生物制品鉴定所)、香草醛(分析纯，湖南湘中地质实验研究所)、冰醋酸(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)、甲醇(分析纯，武汉市洪山中南化工试剂有限责任公司)、高氯酸(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)、正丁醇(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)、异丙醇(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 龙葵草的预处理 将采集的新鲜龙葵草洗净，阴干，粉碎，得龙葵草粉末，储存于阴凉室温干燥处，备用。

1.3.2 标准曲线的制备 精密称取薯蓣皂苷标准品1.00 g，使用甲醇定容于10 mL容量瓶中，制成薯蓣皂苷-甲醇标准液备用。精密吸取60、120、180、240、300、360 μL置于10 mL容量瓶中，水浴蒸干甲醇溶剂，冷却后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL，振摇溶解后加入高氯酸1.6 mL，摇匀后放入70 ℃水浴15 min，然后流水冷却，然后使用冰醋酸溶液定容至10 mL，摇匀后放置10 min；相同条件下不加标准品溶液制备空白溶液，于545 nm处测量吸光度，制备标准曲线[20]。回归方程为A=0.005 5C+0.009 4，R2=0.994 7。

1.3.3 龙葵皂苷类成分的测定 将龙葵草干燥研磨过筛后，精密称取龙葵草粉末1.00 g，置于具塞锥形瓶中，加入适量的石油醚处理1 h，过滤，滤渣挥干溶剂。按一定的料液比加入乙醇，在一定温度和时间下提取，将滤渣再次在相同的条件下提取。合并滤液，减压浓缩得到粗品。再加盐酸溶液混悬，用正丁醇萃取，合并有机相，挥去正丁醇，甲醇定容后即可测定吸光度，根据标准曲线计算出各条件下皂苷类化合物含量，并换算出皂苷类成分的提取率。

1.3.4 龙葵皂苷类成分提取单因素试验

1.3.4.1 乙醇体积分数对皂苷提取率的影响 精密称取龙葵草粉末1.00 g，控制提取温度为70 ℃，提取时间为4 h，提取料液比为1∶15(g/mL,下同)，提取次数为4次，研究乙醇体积分数70%、80%、90%、100%对龙葵草中皂苷类成分提取率的影响。

1.3.4.2 提取时间对皂苷提取率的影响 精密称取龙葵草粉末1.00 g，控制乙醇体积分数为90%，提取料液比为1∶15，提取温度为70 ℃，提取次数为4次，研究提取时间2、4、6、8 h对龙葵草中皂苷类成分提取率的影响。

1.3.4.3 提取温度对皂苷提取率的影响 精密称取龙葵草粉末1.00 g，控制乙醇体积分数为90%，提取时间为4 h，料液比为1∶15，提取次数为4次，研究提取温度30、50、70、90 ℃对龙葵草中皂苷类成分提取率的影响。

1.3.4.4 料液比对皂苷提取率的影响 精密称取龙葵草粉末1.00 g，控制乙醇体积分数为90%，提取时间为4 h，提取温度为70 ℃，提取次数为4次，研究提取料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25对龙葵草中皂苷类成分提取率的影响。

1.3.4.5 提取次数对皂苷提取率的影响 精密称取龙葵草粉末1.00 g，控制乙醇体积分数为90%，提取时间为4 h，提取温度为70 ℃，料液比为1∶15，研究提取次数1、2、3、4次对龙葵草中皂苷类成分提取率的影响。

1.3.5 龙葵皂苷类成分提取响应面分析试验 为了进一步探讨乙醇提取龙葵皂苷的工艺条件，根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，综合考虑后，以乙醇体积分数、提取时间、料液比3个因素为自变量，分别用X1、X2、X3表示，并以1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，以皂苷提取率为响应值Y，响应面设计因素和水平如表1所示。

表1 龙葵皂苷类成分提取响应面设计因素和水平

2 结果与分析

2.1 龙葵皂苷类成分提取单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对皂苷类成分提取率的影响 由图1可以看出，随着乙醇体积分数的增大，提取液中皂苷类成分的提取率增大；当乙醇体积分数增大到90%时，皂苷类成分的提取率最大；再增大乙醇体积分数，皂苷类成分的提取率下降。因此，选择乙醇体积分数90%为宜。

图1 乙醇体积分数对龙葵皂苷类成分提取率的影响

2.1.2 提取时间对皂苷类成分提取率的影响 由图2可知，提取液中皂苷类成分的提取率随提取时间的变化而不同。当提取时间达到4 h后，提取率最高。如再增加提取时间，则龙葵草中干扰成分增加，提取效率降低。因此，选择最佳提取时间为4 h。

图2 提取时间对龙葵皂苷类成分提取率的影响

2.1.3 提取温度对皂苷类成分提取率的影响 如图3所示，温度对龙葵草中皂苷类成分提取率有较明显的影响。在常温下，龙葵草中皂苷类成分的溶出较慢；当温度逐渐增大时，皂苷类成分的溶出加快；当温度上升到70 ℃后，提取液中皂苷类成分的提取率减少，可能与高温下皂苷类成分的分解加快有关。因此，选择提取温度70 ℃为宜。

图3 温度对龙葵皂苷类成分提取率的影响

2.1.4 料液比对皂苷类成分提取率的影响 由图4可以看出，料液比达到1∶15时，龙葵草中皂苷类成分已基本溶出，再增大提取液用量会增加溶剂与能量的浪费。当料液比达到1∶20时，提取液中皂苷类成分的含量反而下降，可能与提取液中杂质含量相对增加有关，也可能是龙葵草中的杂质成分竞争性溶出不利于龙葵草中皂苷类成分提取[21]。因此，选择提取料液比1∶15为宜。

图4 料液比对龙葵皂苷类成分提取率的影响

2.1.5 提取次数对皂苷类成分提取率的影响 如图5所示，随着提取次数的增加，皂苷类成分的提取率逐渐增加，当提取次数为4次时，提取液中皂苷类成分的含量较3次时增加幅度较小，综合考虑，选择提取3次为宜。

图5 提取次数对龙葵皂苷类成分提取率的影响

2.2 龙葵皂苷类成分提取响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果 利用Design-Expert V8.0.6.1中Box-Behnken模型，按照表1中的因素水平进行试验。将因素X1作(X1-90)/5变换；因素X2作(X2-4)/1变换；因素X3作(X3-15)/5变换，将因素水平变换为其编码值。响应面试验结果见表2。

利用Design-Expert软件对表2数据进行二次多元回归拟合，得到皂苷提取率(Y)与乙醇体积分数(X1)、提取时间(X2)和料液比(X3)的二次多项回归方程：

表2 龙葵皂苷类成分提取响应面优化试验结果

表3 响应曲面二次回归方程模型方差分析

注：* 表示显著(P< 0.05)；**表示极显著(P<0.001)。

2.2.3 响应曲面的分析 由图6可知，提取时间对龙葵草中皂苷类成分提取率的影响最为显著，曲线变化幅度较大；其次是料液比和乙醇体积分数，曲线变化幅度平缓，这与方差分析的的结果一致。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[22]。由图6中等高线可以看出，乙醇体积分数和提取时间之间的交互作用较显著，表现为等高线呈椭圆形。相比较而言，乙醇体积分数和反应时间之间的交互作用较小，表现为等高线呈近圆形。

2.2.4 最佳提取工艺条件的确定及验证 利用Design-Expert软件中Box-Behnken模型，在回归方程基础上计算得出理论可获得龙葵草中皂苷类成分提取率的最佳提取工艺为：乙醇体积分数为88.29%、提取时间为4.57 h、提取料液比为1∶14.69，在此条件下，龙葵草中皂苷类成分的提取率理论上可达到2.505 3%。

图6 乙醇体积分数、提取时间、料液比交互作用对皂苷类成分提取率影响的响应曲面和等高线

为了检验试验结果与理论情况是否一致，在乙醇体积分数88%、提取时间4.5 h、提取料液比1∶15、提取温度70 ℃、提取次数为3次的试验条件下重复3次 试验，龙葵草中皂苷类成分提取率的平均值为2.489 8%，与回归方程得出的理论值比较接近，说明采用响应面法优化得到的皂苷提取条件可靠。

3 结论

本研究中建立了一个以龙葵草皂苷类成分提取率为目标值，以乙醇体积分数、提取时间和料液比为因子的数学模型。方差分析结果表明该模型拟合度较好。通过Design-Expert软件对回归方程进行优化计算，得到最佳提取工艺条件：乙醇体积分数88%、提取时间4.5 h、料液比1∶15。回归模型可较好地预测龙葵皂苷的提取率，为充分利用中药龙葵资源提供了依据。为了验证实验结果的准确性，采用上述最佳提取条件进行3次验证试验，并得到的平均提取率为2.489 8%，与预测值2.505 3%基本相符，说明响应面优化法对龙葵皂苷提取条件的优化是可行的。该研究结果也为在大别山区实现龙葵皂苷产业化及综合利用提供了理论依据。

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Optimum Extraction Process of Saponins fromSolanumnigrumL.by Response Surface Methodology

WU Wei1,2,ZHANG Yun2,XIANG Fu1,3*
(1.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains,Huangzhou 438000,China; 2.Medical College,Hubei Polytechnic University,Huangshi 435003,China; 3.College of Life Sciences,Huanggang Normal University,Huangzhou 438000,China)

In order to investigate the extraction technology of saponins fromSolanumnigrumL.in Dabie Mountains,the effect of key factors,such as ethanol concentration,extraction time,temperature,solid-liquid ratio and extraction times on the yield of saponins were studied based on single factor test,and the extraction technology was further optimized by response surface optimization test.Results showed that the optimal extraction conditions were ethanol concentration of 88%,extraction time of 4.5 h,solid-liquid ratio of 1∶15(g/mL),extraction temperature of 70 ℃,and extraction times of 3.Under these conditions,the extraction rate of saponins was 2.489 8%,which approached the theoretical value of 2.505 3%.

SolanumnigrumL.; saponins; extraction; response surface methodology

2016-03-14

大别山特色资源开发湖北省协同创新中心创新团队项目(2015TD07); 矿区环境污染控制与修复湖北省重点实验室开放基金项目(2012105); 湖北省教育厅指导性项目(B2014023)

吴 伟(1979-)，男，湖北咸宁人，副教授，博士，主要从事生物技术药物研究。E-mail:woowe97417@126.com

*通讯作者：向 福(1977-)，男，湖北利川人，副教授，博士，主要从事天然植物资源利用研究。E-mail:lc_xiangfu@163.com

S567.23+9

A

1004-3268(2016)09-0153-06