酸法提取活性污泥中生物絮凝剂及其成分研究

易 诚，陈 敏，黄 丽，龙九妹

(衡阳师范学院 生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008)

酸法提取活性污泥中生物絮凝剂及其成分研究

易 诚，陈 敏，黄 丽，龙九妹

(衡阳师范学院 生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008)

为寻找适合于二次流混凝沉降好氧颗粒污泥的培养的生物絮凝剂，以污水处理厂二沉池污泥为原材料，利用盐酸提取其中生物絮凝剂。结果表明：以18 %的盐酸溶液提取，污泥量为100 mL时、添加盐酸15 mL，搅拌速度700 r/min，提取时间为15 min，提取率达4.11 %，经检测其多糖含量为23.10 %(w/w)，蛋白质含量为29.83 %(w/w)。

生物絮凝剂；污泥；盐酸提取法

絮凝技术作为一种重要的水体净化技术，有着广泛的应用，但是近年来因化学絮凝剂的大量使用而带来的环境及人体健康问题，使得新型絮凝剂的制备、选择及应用研究越来越受到重视。生物絮凝剂是一类由微生物产生的，可使液体中不易降解的固体悬浮颗粒凝聚、沉淀的特殊高分子代谢产物[1]。生物絮凝剂具有絮凝沉降效果好，因其可生物降解性，安全无毒、不造成二次污染，受到国内外学者越来越多的关注。但微生物生培养条件苛刻，制备成本高，如何降低成本？从活性污泥中提取生物絮凝剂[2]应该是最理想的方法，一方面可以解决剩余生物污泥对生态环境的破坏和人类活动构成威胁，另一方面还能合理利用污泥中的有效成分，避免资源浪费，大大降低生物絮凝剂的生产成本[3-7]。

本文选用盐酸提取法提取活性污泥中的生物絮凝剂[6]，为提高提取效果，对酸提取法的条件进行正交优化，对得到的生物絮凝剂进行蛋白质及多糖含量进行分析，并通过提纯得到纯生物絮凝剂,为二次流混凝沉降好氧颗粒污泥的培养提供良好的絮凝剂。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

供实验材料采自衡阳市城西污水处理厂的剩余污泥，污泥置于室温下静置8-24 h后倾去上清液，得到的重力浓缩污泥，其浓度为：15.0-22.0 g/l，VSS/SS为60.0 %-80.0 %，pH值为：6.0-7.5。

1.1.2 实验试剂

盐酸、氢氧化钠、考马斯亮蓝G250、苯酚、葡萄糖、浓硫酸等均为分析纯

1.1.3 实验仪器

TGL-16C高速离心机，上海飘深机械有限公司；SH05-3T恒温磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器有限公司；HH-4恒温水浴锅，江苏省金坛市环宇科学仪器厂；JA2603B电子天平，上海衡祥电子衡器有限公司；722型可见分光光度计，宁波力胜仪器有限公司；DGG9030A鼓风烘箱，上海岛韩实业有限公司。计时器、过滤装置、烧杯、锥形瓶、试管、玻璃棒、量筒、移液管等。

1.2 实验方法

1.2.1 酸法提取条件的确定

以剩余污泥为原料，利用酸提取法进行生物絮凝剂的提取，根据相关文献[8]及初步实验，取自由沉降24 h的活性污泥 100 mL(浓度为21.58 g/l)，加入10 mL、18 %的盐酸溶液，将其搅拌700 r/min，提取时间为10 min, 提取后取悬浊液离心10 min(8 000 r/min),离心的上层清液即为水提取的粗絮凝剂，经提取和提纯[9]，提取率为3.40 %，正交实验以此为基数进行优化设计。

1.2.2 絮凝剂中多糖测定[3]

多糖在浓硫酸的作用下，水解生成单糖，之后迅速脱水生成糖醛衍生物，该类衍生物可与苯酚缩合生成有色化合物，再用分光光度法测定。

最大吸收波长选择：吸取0.04 mg/mL，无水葡萄糖溶液1.00 mL，置10.0 mL具塞试管中，去离子水稀释至2.0 mL，加入6 %(w/w)苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加98 %(w/w)浓硫酸5.0 mL，在水浴中加热15 min，取出后冷却至室温。以去离子水代替糖溶液如上述方法配制空白。用分光光度计测定最大吸收波长在490±5 nm。

标准曲线的绘制：分别精密吸取0.01 mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分置于10 mL具塞试管中，加入去离子水稀释至2.0 mL，加入6 %(w/w)苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，置于沸水水浴中加热15 min，取出后冷却至室温。以蒸馏水代替糖溶液如上述方法配制空白。用分光光度计在490 nm测定吸光度，绘制葡萄糖浓度—吸光度标准曲线。

1.2.3 絮凝剂中蛋白含量测定

蛋白质分子具有酰胺基团，棕红色的考马斯亮蓝-G250染料上的阴离子可以与蛋白质上的酰胺基结合，使溶液变为蓝色。其最大吸收峰位置由465 nm变到595 nm，此时蛋白质与染料结合物在此波长下的吸光度值与蛋白质含量成正比。

蛋白质标准溶液的制备：精确称取牛血清蛋白12.800 0 mg，用少量蒸馏水溶解定容至100.00 mL，即为0.10 mg/mL蛋白质标准液，置于冰箱中保存。

考马斯亮蓝G-250溶液的制备：精确称取考马斯亮蓝G-250 100 mg，加入95 %乙醇50.0 mL，再加入85 %磷酸100.0 mL,最后用蒸馏水定容至1 000.00 mL。置于棕色容量瓶中备用。

标准曲线的绘制：分别精密吸取标准蛋白质溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于10 mL具塞试管中，各管加水至1.0 mL。加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0 mL，摇匀，放置10 min，于595 nm处测定其吸光度。

1.2.4 生物絮凝剂的提纯

将最佳条件下提取的絮凝剂剂液用孔径为3 um的慢速滤纸过滤，并将过滤后的清液稀释到150 mL。并用4 %(w/w)的氢氧化钠溶液调节粗絮凝剂溶液的pH值到9.0，其中有大量的沉淀生成，再向其加入200 mL的95 %乙醇静置15 min,离心分离(8 000 r/min)，取固体加入10.0 mL去离子水，搅拌(440 r/min)均匀，将浊液置于截留分子量为10 000Da透析袋中以流动的去离子水透析24 h。离心分离(8 000 r/min)透析后的浊液，取固体置于40 ℃下干燥。

2 结果与分析

2.1 酸提法最佳提取条件的确定

根据初步实验结果，取盐酸用量、提取时间、搅拌速度进行正交实验L9(3)4，以提取和提纯后的量为参照，参数设计见表1，实验结果见表2。

表1 因素水平表

表2 L9(3)4正交实验分析表

从表1、表2中可以看出，对活性污泥中生物絮凝剂提取的试验中因素影响顺序为A>B>C，添加盐酸的量为最大影响因素，其次是提取时间，而转速影响最小，试验中最高提取率达4.03 %，通过分析其最佳组合A3B3C2，经过验证实验表明其提取率为4.11 %，说明本实验的最优条件为A3B3C2。微生物产生的絮凝剂物质为糖蛋白、粘多糖、蛋白质、纤维素、DNA等高分子化合物，在酸性条件下，有利于蛋白质等物质的变性离析，添加酸量对蛋白质的影响明显不同。同时，从实验结果可以看出，提取时间对提到率有较大的影响，说明在提取过程中，除蛋白质变性离析以外，多糖类物质酸解后的溶解随时间而增加。在搅拌转速中，一则可能取值递度过少，二则可能最低转速过大，以至于转速对提取的影响不是明显

2.2 生物絮凝剂的成分分析[10]

2.2.1 污泥生物絮凝剂的多糖成分分析结果

2.2.1.1 多糖的标准曲线

根据1.2.3絮凝剂中多糖测定中标准曲线绘制的步骤，得出多糖的标准曲线如图1。

图1 多糖标准曲线

2.2.1.2 絮凝剂中多糖测定

取分离出来的絮凝剂2.0 mL置于10 mL具塞试管中，加入6 %(w/w)苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，置于沸水水浴中加热15 min，取出后冷却至室——用分光光度计测定最大吸收波长在490 nm处测定吸光度，对比标准曲线，测定出絮凝剂中多糖的含量(见表3)。

表3 絮凝剂中多糖的含量

从表3可以看出，絮凝剂中多糖最高含量近27.14 %，最小为18.46 %，平均含量为23.10 %(w/w)。

2.2.2 污泥生物絮凝剂的蛋白质成分分析

根据1.2.3中蛋白质含量的测定方法得出蛋白质含量的标准曲线如图2

取絮凝剂提取液各1.0 mL入10 mL具塞试管中，加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0 mL，摇匀，放置10 min，于595 nm处测定其吸光度。对比标准曲线，测定出絮凝剂中蛋白质的含量(见表4)

图2 蛋白质含量标准曲线

试验号123456789絮凝剂提取量/mg74.2477.2682.0077.2680.9383.7375.9686.9785.46蛋白质/mg21.1520.7724.4422.8424.9024.8721.5928.9926.96占絮凝剂比例/%28.4926.8829.8029.5730.7729.7028.4233.3331.55

从表4中可以看出，絮凝剂中蛋白质的含量最高为33.33 %，最低为0.88 %，平均含量为29.83 %(w/w)

3 结 论

以污水处理厂二沉池污泥为原材料，以18 %的盐酸作为提取剂所，通过正交实验确定提取污泥的量、盐酸添加量、离心转速和提取时间等因素，表明提取时间为最大影响因素，其次是盐酸的添加量，确定以100 mL的污泥量，15毫升的18 %盐酸，搅拌速度700 r/min，提取时间为15分钟条件下的生物絮凝剂的提取率为4.11 %。通过硫酸苯酚法和考马斯亮蓝法测得多糖含量23.10 %(w/w)，蛋白质含量为29.83 %(w/w)。

[1] 韩省,黄晨野,刘超,等. 生物絮凝剂的研究进展及展望[J].山东食品发酵,2011(3):32-35.

[2] 孙杰, 张秀红, 李星泊,等. 液氮冻融破碎生物污泥制备生物絮凝剂[J].环境工程,2013,31(1):126-129.

[3] 李大鹏,马放,侯宁,等.味精废水资源化制备复合型生物絮凝剂[J].湖南大学学报(自然科学版),2009,36(9):76-82.

[4] WANG SG.,GONG W X,LIU X. W,et al. Production of a novel bioflocculant by culture of Klebsiella mobilis using dairy wastewater[J].Biochemical Engineering Journal,2007,36(2):81-86.

[5] 周秀秀,戴晓晴,王春晖,等.剩余污泥中微生物絮凝剂的提取方法比较[J].环境工程学报,2013,7(8):2808-2812.

[6] 张志强,李向蓉,张姣,等.超声法从剩余污泥中提取微生物絮凝剂的研究[J].同济大学学报(自然科学版),2013,41(2):234-239.

[7] 周云,刘英,张志强,等.微生物絮凝剂制备的研究新进展[J].环境污染与防治,2014,36(4):80-85,91.

[8] 孙杰.污泥絮凝剂的制备及其絮凝性能研究[D].大连:大连理工大学,2013.

[9] PAUL D’ABZAC,F B,VAN H B M.Arapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J],Analytical Biochemistry,1976,72(1/2):1589-1599.

[10] ADAV S.S.,LEE D.J.Extraction of extracellular poly-meric substances from aerobic granule with compact interior structure[J].Journal of Hazardous Materials,2008,154(1/3):1120-1126.

(编校 陈志阳)

On Bio-flocculant Extraction By Acid Method from Activated Sludge and Its Components

YICheng,CHENMin,HUANGLi,LONGJiu-mei

(College of Life Science and Environment,Hengyang Normal University,Hengyang Hunan 421008,China)

In order to find suitable biological flocculant for aerobic granular sludge with second flow mixed culture coagulation,with the sludge in secondary sedimentation as raw material,extracting the biological flocculant with hydrochloric acid.Results show that: extracted with 18 % hydrochloric acid solution,when sludge was 100 mL,adding amount of hydrochloric acid was 15 mL,stirring speed was 700 rpm,extraction time was 15 min,the extraction rate was 4.11 %,at last there were 23.10 % polysaccharide (w/w) and 29.83 % protein (w/w) in it with detection.

biological flocculant; sludge; hydrochloric acid extraction method

2016-10-08

湖南省自然科学基金(2015JJ2018)

易诚(1970-)，男，湖南衡阳人,教授,博士, 研究方向:水污染控制。

Q179.1

A

1673-0313(2016)06-0093-04