接触性DNA检验现状与展望

吴 婷，牛青山，王金换，温文娇

（1.湖南警察学院，湖南长沙410138；2.中国刑警学院，辽宁 沈阳110035）

鉴定综述
R e v i e w

接触性DNA检验现状与展望

吴 婷1，牛青山2，王金换2，温文娇2

（1.湖南警察学院，湖南长沙410138；2.中国刑警学院，辽宁 沈阳110035）

随着犯罪嫌疑人的反侦查意识及能力加强，接触性检材在现场提取检材中所占的比重越来越大，现场接触性DNA在案件侦破中发挥的作用也日渐明显。由于人在接触物体后，会在物体表面留下相应的微量接触性DNA，对这类接触性检材的检验分析是目前法医物证检验工作的热点和难点。对接触性检材的现场发现、前期处理及DNA的提取方法、扩增方法、电泳以及结果分析等方面对其检验研究进展综述。希望能够为侦查实战工作在接触类检材的现场发现，提取以及成功检测分型方面提供方法和思路。展望：首先，关于接触性检材的分类按接触物体表面质地分更为合理，因为潜在DNA转移的发生，与物体表面质地及样本的湿度密切相关，而且检材的表面质地很大程度上影响实验者提取方法的选择；其次，现勘人员应该及时出现场并且能结合案情科学地提取、包装并运送检材；再次，我们在处理接触类检材必须做到检验时突出重点部位、选择合适的检验策略与方案；最后，根据接触性检材的检测结果下鉴定意见时应十分谨慎。

法医遗传学；接触性DNA；微量物证；DNA提取；PCR；STR分型

接触DNA虽然微量但是侧重于DNA的来源，因此并不等同于微量DNA（trace DNA、LCN或Lt DNA）。Gill等［6］认为微量DNA的模板量小于100pg；Caddy等［7］认为界定微量DNA模板量的标准为200pg；而Budowle等［8］报道由于DNA定量方法有差异，LCN分型应定义为正常阈值之下的分析结果；Gill等［9］后来发表类似于Budowle的观点。由于在实际刑事案件中接触性DNA的样本原始情况脆弱且DNA含量很少，对这类样本进行STR分型时仍需遵循微量DNA的分析方法。

1　接触性DNA检验的研究现状

1.1接触性DNA检材的现场发现

在案发现场，接触性检材与常规生物检材如血痕、精斑相比，肉眼观察很难判断脱落细胞是否存在及其在载体上的具体部位、数量的多少。杨电等［10］研究表明用于指纹显现的茚三酮薰显技术可用于指导案件中人体脱落细胞的发现采集。而作为法医现勘必备的多普勒光源，蔡能斌等［11］报道经波长为266 nm的紫外光照射后，会严重影响指纹脱落细胞的DNA检验，但对血迹、唾液斑、有毛囊的毛发的DNA检验影响较小。因此在现场勘查寻找发现接触性检材过程中应慎用紫外激光。张天祥等［12］报道了现场生物物证发现的指导策略，提供了一个系统的勘查思维。在接触性DNA中应特别小心避免二次接触的污染和转移。现场发现接触性的有效生物物证后，对其包装和运送同样会对接触性DNA的检测成功率产生巨大影响，因此现勘人员除了做必要防护措施，如戴口罩帽子手套，还要不轻易触碰此类检材，包装时更要小心轻柔，必要时分区域包装。

1.2接触性DNA检材的前期处理及DNA提取

1.2.1剪取法

烟蒂、纸巾、口香糖、甘蔗渣、槟榔渣等这类脱落细胞相对量大的载体检材，可直接剪取适量放入EP管，例如，烟蒂可剪取过滤嘴的外层纸片大小约为1mm×5mm，口香糖剪取 1/2米粒大小；餐后擦嘴纸可剪取擦拭部位大小约5mm×5mm［4］。类似剪取法的还有陈晓晖等［13］报道的割取法提取一次性牙刷上的脱落细胞进行 STR分型效果良好，放置时间越长的牙刷，检出率越低。

1.2.2擦拭法

第四，1988年推行政治体制改革后，戈尔巴乔夫对苏联政治形势的发展在相当程度上处于失控状态，被牵着鼻子走，不得不把主要精力花在处理不断出现的社会政治问题上。仅1988年一年，就开了八次中央全会、两次人民代表大会、两次最高苏维埃会议。在这样的情况下，不可能集中精力来抓经济和经济改革问题。另外，在批判旧的政治体制时，又过多地纠缠历史旧账，强调不留历史“空白点”，引发出一场又一场的大争论，在争论中又缺乏正确引导，导致对历史否定过头、人们思想混乱、党的威信急剧下降，最终苏共垮台，使改革失去了坚强的政治领导核心。对出现的民族问题的复杂性、尖锐性又估计不足。这些情况，对苏联解体都起了作用。

饮料瓶口、果核、电话，工具握柄等这类载体检材，可采用二步擦拭法［14］提取脱落细胞。Sukanya等［15］报道采用不同的拭子和湿润剂的组合，从胶带上脱落细胞中收集到DNA的量不同。Jennifer等［16］研究了志愿者洗手2小时后用主手食指在无菌塑料板上按了指纹，使用尼龙植绒拭子和直接PCR获得完整的STR DNA图谱，且尼龙拭子优于海绵拭子，海绵优于棉签。

1.2.3吸附法

衣服、裤子，鞋子、帽子、手套等渗透性检材可采用吸附法提取脱落细胞。如衣服、裤子类载体，用脱落细胞提取仪充分在衣领、袖口、腋窝、裤头、口袋入口等直接接触人体皮肤处吸取，手套类载体，翻转后吸取内面的掌指部位，从脱落细胞提取仪上取下的三层滤膜分别用三个EP管处理。Goray等［17］报道与非渗透性载体相比，皮肤脱落细胞更容易沉积在渗透性载体上，而且渗透性载体不易发生二次转移。邵武等［18］研究表明负压吸附法，因具有良好的脱落细胞富集能力从而提高脱落细胞检材的检验成功率。胡伟等［19］报道当载体受潮致人体脱落细胞浸润载体后，即使是吸尘器法也因无法吸附足够的人体脱落细胞而无法检测成功，而采用改良标准QIAamp DNA Mini Kit法一次性过柱为反复多次过柱，能实现收集消化液中所有的DNA。

1.2.4粘取法

粘取法主要指利用胶带或粘取器粘取的方法，赵春鹤等［20］发明的粘取器成功收集到粘附在衣服袖口、剪刀柄、水杯、手表，手套、鞋带、拖鞋等20多份不同载体上的脱落细胞，并成功检验分型。Daly等［21］认为接触性DNA用小胶带粘取的收集检测成功率，在木质，纺织物，玻璃三种载体依次降低。巴华杰等［22］研究表明对表面积较大的检材，分区检验尤为重要，而采用先粘取表层，再吸取的方式，可以降低了背景DNA的影响，从而获得了单一DNA分型结果。田蕊等［23］研究显示EZ-Tape分区粘取法与真空负压吸引法相比，更有针对性，能够减少混STR峰型出现的几率。

1.2.5单细胞显微捕获

胡兰等［24］报道目前获取微量甚至单个细胞的方法主要有流式细胞仪分离法、激光捕获显微切割分离法、显微操作仪捕获法等。显微捕获技术的关键在于镜下上皮细胞和皮肤脱落细胞的准确区分。该技术的基础在于人体不同部位被覆的上皮细胞是有区别的，如口腔、食道和阴道等腔面与皮肤表皮，前三者被覆的是未角化的复层扁平上皮细胞，有胞核，且胞质内含角蛋白少；而后者浅表细胞为角化的复层扁平上皮，无细胞核，且胞质内充满角蛋白［25］。顾丽华等［26］利用激光捕获显微切割分离获得了7～8个细胞的成功分型。曾宪海等［27］采用激光显微切割技术、PALM系统收集接触性检材上的目标细胞。但是此方法操作繁琐，仪器及技术要求更高，目前不能普遍应用于基层DNA实验室。

1.2.6DNA的提取

成功检测接触性检材的关键在于能否收集到尽可能多的脱落细胞用于DNA的提取。除了在检验时要突出重点部位，还要合理评估并恰当选择微量DNA的提取方法。在国内外，有许多方法被报道应用于接触性DNA的提取及纯化，概括起来有Chelex法、磁珠法、有机溶剂法（有机法）、过柱法、硅珠法、硅胶膜法等。其中磁珠法还有半定量作用，7μL IQ磁珠约吸附100 ng的DNA。牛青山等［28］应用抗-DNA单克隆抗体免疫胶体金技术从溶液中直接捕获微量DNA，形成DNA--免疫胶体金复合物沉淀，直接用于PCR反应，极大地提高了微量生物检材DNA的检测成功率。杨电等［29］报道采用小体积Chelex-100法可对60%左右的微量口腔脱落细胞检材提取DNA并进行STR分型。而姚建等［30］采取增加取材量和在1.5mL离心管中大体系消化后用硅珠法纯化DNA，能显著提高检验成功率。

Sewell等［31］报道在对纸张接触性DNA的提取上，DNeasy plant mini kit（QIAGEN）比QIAamp mini kit.更具优势，某些纸张例如报纸，杂志，滤纸比普通办公打印纸检测成功率更高。杨电等［32］报道分别采用 95℃、70℃直接裂解和 TNE、SDS、PK预消化方式进行前处理接触性检材，磁珠法提取 DNA，有助于提高检验成功率。刘海渤等［33］报道磁珠法和改良磁珠法（MagAttract DNA MiniM48+Carrier RNA（cRNA））均能有效检测接触性检材脱落细胞DNA，后者更优。其中，刘海渤研究结果的分型成功的标准是获得个体性别基因座和9个STR基因座的明确基因型。

杨电［34］比较研究了经Chelex法、DNA IQ磁珠法、EQ国产磁珠法、有机法、Microcon过柱法等5种DNA提取纯化方法处理后，进行PCR定量，每种DNA提取纯化方法对接触性DNA的回收率。杨电等［35］报道大部分接触DNA检材采用DNA IQ磁珠法结合MaxwellTM16自动仪可提取到足以进行STR分型的DNA。有报道国产磁珠结合自动化工作站批量提取接触细胞检材的成功率较低，故不提倡使用。

1.3接触性DNA的扩增方法

正确的提取方法决定了检验是否成功，而接触性DNA微量，应该选取适用的扩增方法，以达到最好的检验结果。接触DNA进行STR检验时，对PCR条件进行改良，通过增加循环数、梯度扩增、模板浓缩、优化引物、调整反应体系、延长退火时间、改良缓冲体系、增加聚合酶量、使用针对降解DNA和微量DNA设计的mini-STR试剂盒等不同的方法来提高检验的灵敏度。

一般来说，通过增加PCR循环数，低至100pg的DNA样本均能获得STR分型结果。Sangeeta等［36］报道接触DNA样本中，LCN型（增加额外循环）和miniSTR联用的策略可得到满意的结果。Luke等［37］认为使用28循环+纯化+多进样的方法能得到相同或更好的数据。NFI改良了28次循环的实验方案，他们在28次循环之后，加入新鲜的DNA聚合酶，继续扩增6次［38］。这种28+6的方法使我们能检测到28次循环扩增产物，从而避免34次强化循环生成的过量DNA用于检测。Seung等［39］报道低温退火及延伸的步骤会降低stutter比例，低温PCR：Identifiler扩增，32循环，56度退火，56度延伸。

直接扩增法在接触性检材上的运用也有报道，毛坤云等［40］报道载体法可提高微量生物检材中DNA检出率。商业化的直扩试剂盒具有抗污染能力强，扩增时间短，适应检材广泛等特点。李长征等［41］研究表明Identifiler Direct试剂盒直扩法用于接触性DNA成功率明显高于常规Chelex提取法。

全基因组扩增（whole genome amplificationWGA）技术。Lasken等［42］报道对纳克级别的微量样本而言，WAG技术可能在一定程度上能达到富集样本的目的，但在皮克级别，其并非良策。该实验成本较高，无法在基层实验室普及使用。

1.4接触性DNA的电泳及结果分析

在电泳时，通过增大注样电压和延长注样时间，提高毛细管电泳的PCR产物进样量，也能提升检测灵敏度。另外，还有关于PCR产物纯化的方法，使毛细管电泳的信号得以增强。由于通过电动进样，注入毛细管电泳仪的DNA的量与样品中的盐含量成反比，因此PCR产物的纯化这一步就是为了降低电泳前样品中盐含量。目前，实验室普遍采用的是低导电性的甲酰胺稀释样本。也有专门的试剂盒供选择，如：MinElute试剂盒（QIAGEN）、Montage试剂盒（Millipore）、Performa DTR凝胶滤柱（Edge BioSystems）。

接触性材作为低拷贝（LCN）DNA中的一种，检出结果可能出现等位基因漏检、插入、不均衡扩增等现象，因此在判断接触性检材STR分型时必须谨慎，要观察等位基因的RFU值、信噪比，同时应该设置阳性、阴性对照来监测实验数据的可靠程度。Sangeeta等［43］认为重复分型结果的比较用可来识别伪峰，并提供一个完善的图谱，重复扩增确认一致性是必需的。在进行接触性检材DNA结果报告时可以参照John［38］的微量DNA样本分析的注意事项和挑战。

2　接触性微量物证DNA检验存在的不足及展望

国内外对于接触性DNA检验的研究做了大量工作，但是接触性检材的检验成功率仍然不高。首先，对现场接触性检材的发现不能做到及时或有效，现勘人员应该及时出现场并且能结合案情科学地提取、包装并运送检材。其次，对于极微量的接触性检材没有完全行之有效的提取方法，在处理接触类检材必须做到检验时突出重点部位、选择合适的检验策略与方案。目前，接触性检材所含DNA可以用于成功检测的量的范围并无文献报道。最后，对于接触性检材的结果分析仍然是难点，并且由接触性检材DNA模板分析获得的图谱，也未必与案件有关，有可能是案发前就已遗留，所以根据接触性检材的检测结果下鉴定意见应十分谨慎。

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（本文编辑：李成涛）

Advances in Touch DNA Testing

WU Ting1，NIU Qing-shan2，WANG Jin-huan2，WEN Wen-jiao2
（1.Hunan Police Academy，Changsha 410138，China；2.National Police University of China，Shenyang 110035，China.）

With the increasing counter-investigation awareness and capacity of criminals，touch DNA has larger proportion in the samples collected at crime scenes，and is gradually playing a more obvious role in solving cases.People leave trace DNA on the surface when they touch an object.The touch DNA testing is the focus and difficulty of forensic biology research.The authors review the studies of touch DNA in the following aspects:the discovery and dispose of contact samples on the scene，the method for DNA extraction and amplification，electrophoresis，and analysis methods.Moreover，the authors rasies their own opinions:First，it is more reasonable to classify the touch DNA by the surface texture of the objects，not only because the transfer of potential DNA is closely related to the material quality and the humidity of samples，but also because the material quality greatly affects the choice of extraction methods.Secondly，the investigators should arrive at the crime scene in time，and collect，pack and submit the samples scientifically under specific conditions. Thirdly，the analysts must know the key parts in examination，and choose appropriate analyzing methods.Lastly，the conclusions drawn from the testing result of touch DNA should be very cautious.

forensic genetics；touch DNA；trace biological evidence；DNA extraction；PCR；STR genotype

DF795.4

Adoi:10.3969/j.issn.1671-2072.2016.05.011

1671-2072-（2016）05-0066-05

2016-03-21

吴婷（1988—），女，助教，硕士，主要从事法医物证学研究。E-mail:ya.tsing@163.com。