大豆microRNA研究进展

张宇鹏，翟　红，吴红艳，夏正俊

(1.中国科学院 东北地理与农业生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150081；

2.中国科学院大学，北京 100049)



大豆microRNA研究进展

张宇鹏1,2，翟红1，吴红艳1，夏正俊1

(1.中国科学院 东北地理与农业生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150081；

2.中国科学院大学，北京 100049)

摘要：MicroRNA(miRNA)是长度为20~25核苷酸的非编码RNA，在真核细胞内通过定向降解靶基因mRNA、抑制其翻译及转录后水平抑制等方式来调控靶基因的表达。鉴于高通量测序技术和生物信息学的迅猛发展，大豆miRNA的鉴定及功能研究方面取得了长足的进步。文章简述了大豆miRNA在基因组层面、共生固氮、生长发育及开花和生物胁迫与非生物胁迫等生物学过程的研究进展。参55。

关键词：microRNA；大豆；功能；共生固氮；生长发育；开花；胁迫

0引言

真核生物中的小RNA可以分为：microRNA、siRNA(Small interfering RNA)、tasiRNA(Trans-acting siRNA)、natsiRNA(Natural antisense transcript-derived siRNA)和piRNA(Piwi-interacting RNA)[1]。MicroRNA(简称miRNA)是一类长度约为20~25 核苷酸，不编码蛋白质的内源小分子RNA。miRNA最初于1993年在秀丽隐杆线虫中被发现[2-3]，进一步研究表明其广泛存在于植物体内。miRNA主要通过与靶基因mRNA结合，在转录后水平上调节靶基因的表达，是真核生物基因转录过程的重要调控因子[4-5]。miRNA在植物中由RNA聚合酶II进化而来的RNA聚合酶IV和V转录合成。miRNA在转录后形成末端带有多聚腺苷的初级转录本(pri-miRNA)，初级转录本再经由DCL1酶作用剪切形成茎环状前体(pre-miRNA)，最后在 Dicer和其他一系列蛋白协同作用下形成为miRNA成熟体[6-7]。有研究表明，在拟南芥和蒺藜苜蓿中一些miRNA的初级转录本可以编码并翻译成短肽(miPEP)，这些初级转录本编码的短肽有利于成熟miRNA的积累[8]。

miRNA不仅在植物的生长发育中起着重要作用，它还是基因调控网络中的重要组成部分。在植物中，miRNA与靶基因mRNA的互补程度很高，匹配位点通常在开放阅读框中，导致mRNA与miRNA的匹配区中间位置特异性切割。目前已明确植物miRNA参与包括激素信号转导、细胞代谢、器官分化发育及育性转换等多个植物生长发育过程[9]。miRNA能响应生物及非生物胁迫，可以诱导产生phasiRNA(phased small interfering RNA)来参与到植物抗病的生理过程中[10]。

目前，对模式植物(如拟南芥，水稻等)的保守miRNA的表达及调控特性的研究较为深入，而其他植物物种的miRNA的研究还主要处于种类鉴定与生物信息学功能预测阶段。大豆作为世界上重要的油料作物和粮饲兼用作物，已经成为仅次于水稻和蒺藜苜蓿发现miRNA数量较多的物种。著名miRNA数据库miRBase[11](miRBase.org，Release 21)中包含265个栽培大豆(Glycinemax)发现miRNA家族，573个miRNA成熟体序列；9个野生大豆(Glycinesoja)miRNA家族，13个成熟体miRNA序列。随着高通量测序技术应用于miRNA测序，相信在未来的几年内，miRBase中包括大豆在内的植物miRNA数据还会快速增长。然而，人们对新发掘的miRNA种类的功能还知之甚少，大豆miRNA的研究与模式植物相比还处于起步阶段。但近些年来关于大豆miRNA在大豆中调控多种生理过程的文献越来越多，发现了很多豆科及大豆特有的miRNA，并研究了部分种类miRNA，如miR172[12-13]、miR167[14-15]在大豆中的功能及作用方式。文章对大豆中miRNA在大豆共生固氮、生长发育和抗逆性等重要生物学过程中的生物学功能方面的研究进展加以阐述，旨在为进一步深入研究提供借鉴和参考。

1大豆miRNA种类及进化

1.1大豆miRNA种类

大豆中存在大豆特异的miRNA家族(73个)，豆科特异的miRNA家族(9个)和保守性的miRNA家族[16]。研究表明，与大豆和豆科特异的miRNA家族相比，大豆中保守的miRNA家族的成员数量更多，并且产生成熟miRNA种类更少。大多数保守和豆科特异的miRNA家族编码产生长度为21 核苷酸且具有独特核苷酸分布的成熟miRNA。与大豆特异的miRNA家族相比，保守的miRNA家族能调控一系列更为保守的基因[16]。

1.2大豆miRNA进化及结构

具有物种保守性的miRNA在植物进化初期就完成了分化；而特异性miRNA的进化始于植物种群分化后，因而物种间保守性较低[17]。Zhou等认为miRNA基因的进化与多种因素有关，如毗连的基因与转座子，所处位置的重组率及其本身结构的多样性有关[18]。在大豆中，一些可以共同形成一个初级转录本(pri-miRNA)的miRNA距离很近，成簇串生。大豆是古四倍体，在进化中历经两次染色体加倍事件[19]。与蛋白编码基因相比，大豆中的miRNA也随着大豆染色体的倍增而扩增 。研究表明多拷贝的miRNA基因的存在与进化和基因组稳定性及其相邻的编码基因密切相关[20]。

在大豆基因组中，大多数miRNA基因存在于基因间区，但也有位于基因内部区域来源于蛋白编码基因本身的miRNA基因(常小于1 000 bp)，存在于基因内部miRNA与其源基因可能存在着明确的调控关系。Han等通过降解组测序及生物信息学预测分析发现在大豆440个miRNA中83.86%的启动子是位于其上游序列中，只有8.64%是位于其下游序列中[21]。

2大豆miRNA参与主要生物学过程

2.1大豆miRNA 与共生固氮

研究表明，有多种miRNA通过调控相关结瘤基因的表达来调控大豆根瘤形成这一生物学过程。Li等发现在大豆中过表达miR482、miR1512和miR1515这三种miRNA可以显著地增加根瘤总数，但是根的长度、后生根密度及根瘤原基数目并没有发生改变[22]。Yan等发现miR172过表达植株的根瘤数目会显著增加[13]。miR172的靶基因通常是一些含有AP2结构域的转录因子编码基因[23-24]。在大豆结瘤过程中，miR172c的靶基因NNC1含有AP2结构域。NNC1蛋白通过结合在早期结瘤因子ENOD40(Early noduling 40)的启动子区域，阻止其转录。在根瘤菌侵染时，结瘤因子受体NF1α/5α识别NF(Nodule factor)，并上调miR172c的表达。miR172c通过清除其靶基因NNC1的mRNA，抑制NNC1的表达。NNC1的下调表达将减弱对ENOD40 的转录抑制，从而使ENOD40激活转录并最终促进根瘤的形成。而避免根瘤过量形成则是通过AON信号通路来减少miR172c的表达来实现[12]。

生长素和细胞分裂素在大豆根瘤菌侵染形成根瘤的过程中起着重要作用。生长素会显著抑制根瘤的形成，而细胞分裂素则相反，会促进根瘤的形成[25]。miR167c主要通过调节GmARF8来调节大豆结瘤过程。GmARF8在根皮质细胞中主要响应生长素的累积。在没有根瘤菌侵染大豆根时，miR167c表达水平很低，其靶基因能够翻译表达成蛋白，从而激活生长素响应基因的转录。此时，根皮质细胞对生长素敏感，不能分化，根瘤的形成被抑制。在根瘤菌侵染大豆根后，miR167c表达量上调，并清除其靶基因GmARF8的mRNA，抑制GmARF8的表达，从而减少对下游生长素响应基因的激活，使根皮质细胞对生长素不敏感，可以分化形成根瘤[15]。在大豆根中过表达miR160会导致根对生长素超敏感。而过表达miR393则会使根对细胞分裂素超敏感[26]。在植物中，miR160主要降解ARF10/ARF16/ARF17等ARF基因家族成员的mRNA；miR393则针对生长素受体TIR1/AFB基因家族成员来发挥其调节功能。在过表达miR393时，一些响应生长素的基因是明显下调的；相反，在过表达miR160时，响应生长素的相关基因则会上调表达，而响应细胞分裂素的基因则会明显下调表达。这意味着miR160在大豆结瘤过程中通过调节生长素/细胞分裂素的平衡来实现其调节结瘤这一生物学过程[27]。Mao等发现miR393和miR164影响无限结瘤(Indeterminate nodule)，而不影响有限结瘤(Determinate nodule)[28]。

Yan等通过降解组深度测序发现139种miRNA均不对形成根瘤这一过程产生响应并呈现不同的表达差异。miR393家族成员miR393j-3p则会降解ENOD93(Early noduling 93)的mRNA。在拟南芥中miR393-3p同抗病性相关。miR393-3p同AGO2蛋白结合调控一种定位于高尔基体突触小体相关基因，Membrin12。该基因影响向胞外分泌抗微生物的蛋白[29]。

2.2大豆miRNA与生长发育

大豆的子叶是合成和储存营养物质的组织器官。在大豆子叶中的一些新的miRNA，可能在1 300万年前的第二次基因组倍增之后产生的。这些miRNA在子叶中可以调节许多生物学途径[30]。Shamimuzzaman等通过对大豆种子不同发育阶段组织构建小RNA文库和降解组文库测序发现了53个已知miRNA与其183个靶基因，其中25个miRNA特异降解其靶基因仅发生在子叶，12个miRNA特异降解的靶基因仅在种皮中发现。16个miRNA家族的很多靶基因存于上述的两种组织中的不同生长发育阶段。在种子成熟后期的子叶中发现了比未成熟种子更多的miRNA及其靶基因[31]。一些miRNA通过直接调控脂类代谢相关基因及产生调节脂类代谢基因的phasiRNA来参与到脂类代谢的调控中[32]。

2.3大豆miRNA 与开花及光周期调控

开花调控是开花植物生命周期的一个重要调控过程。miRNA是开花调控中的一个重要因素。miR172-miR156调节模式在大豆中仍然具有一定保守性。在拟南芥中，miR172通过调控其靶基因APETALA2(AP2)以及AP2家族类的转录因子的表达，控制开花时间和花器官的形成[23-24,33]。Zhao等发现在大豆中miR172c及其靶基因GmTOE4a是在E3和E4的作用下，通过调控开花整合因子GmFT2a和GmFT5a，以及花分生组织决定基因GmAP1和GmLFY来实现调控开花的。与模式植物拟南芥不同，大豆miR172及其靶基因GmTOE4a能够调控GmCOL1a的表达，而在转录水平不受生物钟基因GI(E2)的调控。[34]。Cao等在大豆中过表达miR156b，导致植株晚花，发现多种开花调控因子在过表达植株中下调表达[35]。

在大豆花的不同部位发现了组织特异性表达的miRNA。Kulcheski等通过对花瓣、心皮和雄蕊分别构建小RNA文库发现并确认3种已知的miRNA(miR156cde-5p，miR396bck-5p和miR9749)和3种新miRNA在上述组织中差异表达[36]。

对于大豆而言，不同长度的光照时间对大豆开花时间有着显著影响。Li等通过不同日长处理下的大豆第一个三出复叶构建小RNA文库发现总共属于163个miRNA家族的318种miRNA。其中23个miRNA在光照后0小时，65个miRNA在光照后8小时，83个miRNA在光照后16小时响应不同日长[37]。

2.4大豆miRNA 与逆境胁迫

植物在进化过程中形成了应对各种生物胁迫和非生物胁迫的机制。miRNA在这些胁迫中的基因表达调控中也起着重要的作用。明确miRNA响应逆境的机制，有助于深入了解植物在逆境下基因表达调控的本质[38-39]。

2.4.1大豆miRNA 与生物胁迫。大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus,SMV)是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属一种单链RNA病毒。由其引起的大豆花叶病毒病是一种世界性的大豆病害，严重地影响了大豆的产量和品质。Yin等通过测序发现miR160、miR393和miR1510这三种miRNA响应SMV的感染[40]。在烟草和拟南芥中，miR168和AGO1在多种植物病毒侵染时均有上调表达。miR168和AGO1可能通过miRNA和siRNA途径去响应病毒感染。AGO1是RISC(RNA induced silencing complex,RNA介导沉默复合体)中的中心组成部分，同转录抑制或清除互补RNA有关。AGO1表达受miR168调控。AGO1与miR168可能参与到植物主动防御中。在宿主植株的防御反应中，SMV的侵染直接引起AGO1的表达水平上调，而上调的AGO1的mRNA经由siRNA途径介导被降解，从而使AGO1表达水平下降。与此同时，SMV的侵染也引起了miR168的高表达，miR168 的上调直接清除AGO1的mRNA或对AGO1的mRNA进行翻译抑制[41]。

大豆胞囊线虫是大豆世界范围内最严重的病原生物之一。Li等通过对大豆胞囊线虫易感品种和抗性品种在感染大豆胞囊线虫后构建小RNA文库测序发现来源于40个miRNA家族的101种miRNA涉及响应囊胞线虫感染这一过程[42]。Xu等通过对大豆胞囊线虫易感品种和耐受品种构建小RNA文库测序发现在根中六种miRNA(gma-miR393，1507，1510,1515,171,2118)可以产生phasiRNA来响应大豆胞囊线虫侵染[43]。

NB-LRR(Nucleotide binding site-leucine-rich repeat)类蛋白是植物中目前已知的主要抗病蛋白。Zhao等利用大豆疫霉病易感品种及其分别含有不同抗性基因的近等基因系研究发现miRNA中的大部分在病原侵染后产生。在大豆参考基因组中已知的525个NB-LRR基因中的257个是这些miRNA预测的靶基因，126个被预测可以产生phasiRNA。同时他们也发现了一些可能的有转座子产生的phasiRNA[44]。miR393和miR166可以由大豆疫霉菌的菌丝产生。在敲除miR393的植株根中，异黄酮合成基因表达明显减少[45]。Guo等利用miRNA芯片技术也找到了一些同大豆疫霉病相关的miRNA[46]。

2.4.2大豆miRNA 与非生物胁迫。干旱、高盐、低温、金属离子和营养元素的缺乏是影响大豆生长发育的主要非生物胁迫。

水分胁迫不同程度地限制着植物的生长。过表达大豆miR394a(gma-miR394a)会导致植株叶片失水速率降低增加抗旱能力[47]。GmNFYA3在大豆中编码NF-Y复合体的NF-YA亚基。GmNFYA3在大豆受到ABA和非生物胁迫的诱导。miR169可以靶向清除GmNFYA3的mRNA。在拟南芥中过表达GmNFYA3会减轻叶片失水增强干旱耐受能力，增加对高盐和外源ABA的敏感性。GmNFYA3过表达植株中ABA合成，ABA信号通路和干旱响应基因均上调表达[48]。

土壤中过高的盐分也会给植物带来巨大的负面影响[49]。Dong等通过对盐处理及盐不处理的大豆根瘤中建立2个miRNA文库，测序鉴定出来源于61个miRNA家族的110个已知miRNA和128个新miRNA。在两个处理比较中，104个miRNA差异表达[50]。

低温是大豆生长发育过程中最常遇到的逆境。李永光等利用生物信息学分析发现大豆miR1508a的启动子含有多种非生物胁迫响应元件。经软件预测并确认了5个与低温反应相关的候选靶基因[51]。

对于植物来说，任何高浓度的重金属离子都有毒害作用。Fang等对大豆耐镉胁迫品种和镉敏感品种的根中测序时发现了26个响应镉胁迫的miRNA，其中12个只在易感品种中表达，5个只在耐镉胁迫的品种中表达，9个在两个品种都有表达[52]。Zeng等通过对铝处理和无铝处理的野生大豆建立小RNA文库，测序鉴定后发现97个已知miRNA和31个新miRNA，其中30种miRNA是响应铝胁迫的；通过降解组测序发现，有86个基因是已知miRNA的靶基因，8个是新miRNA的靶基因，其中52个靶基因在转录中起调控作用；ARF(Auxin response factor)、NB-ARC(Domain-containing disease resistance protein)、LRR-TIR(Leucine-rich repeat and toll/interleukin-1 receptor-like protein)、阳离子转运ATP酶、Myb转录因子及NAM(The no apical meristem) 等家族的基因均在有铝胁迫的情况下mRNA被清除[53]。Lv等在野生大豆中发现，miR167c响应碱胁迫。在miR167c上游区域存在ABA响应元件(Abscisic acid(ABA)responsive element (ABRE))，两个生长素响应因子(Gs14g03650，Gs18g05330)被预测是miR167c作用的靶基因，在碱胁迫下急剧下调[14]。

磷是大豆生长所必须的大量元素，在植物周期中起着重要作用。Xu等对不同磷处理的大豆叶片和根建立测序文库，鉴定出126种miRNA。在不同处理之中，112种miRNA同时在根和叶中表达。在磷充足的条件下，12种miRNA在叶中特异表达，2种根中特异表达；在缺少磷的条件下，10种miRNA在叶中特异表达，4种在根中特异表达。通过RLM-5’RACE确认，PHO2和GmPT5，一个含有Kelch结构域的蛋白基因，一个Myb转录因子，分别是miR399、miR2111和miR159e-3p的靶基因[54]。Sha等也通过构建小RNA文库测序的方式发现了27个已知miRNA，16个保守miRNA，12个新miRNA在根中响应磷缺失；34个已知miRNA，14个保守miRNA，7个新miRNA在幼苗中响应磷缺失[55]。

3结语

miRNA是生物体内的一类重要的小RNA，具有调控生物体生长发育等多种功能。关于miRNA的生物学及功能的研究已经成为生物学领域的热点之一。在大豆中已鉴定出265种miRNA，文章所阐述的miRNA在大豆中的功能和作用机制大多还处于起始阶段，更多种类及其作用机理有待深入研究。随着测序技术及miRNA研究方法的不断改进，借鉴于模式植物miRNA的研究成果，miRNA在植物体内的生物学功能、作用机制与生长发育调控途径将会得到更清晰地阐释。

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Research Progress of MicroRNA in Soybean

ZHANG Yu-peng1,2,ZHAI Hong1,WU Hong-yan1,XIA Zheng-jun1

(1.NortheastInstituteofGeographyandAgroecology,CAS,Harbin150081,China;2.UnivensityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

Abstract：MicroRNAs(miRNA)are 20~25 nucleotides small non-coding RNA molecules.miRNAs exert their functions by gene silencing either via mRNA degradation or preventing mRNA from being translated or by post-transcription.With the rapid advance in next generation sequencing technology and bioinformatics,abundant miRNAs have been identified,some of which have been functionally analyzed.Here,we review the research progress at genome level as well as in different biological processes,e.g.rhizobia symbiosis,grow development and flowering,biotic and abiotic stress.

Key words：microRNA；soybean；function; rhizobia symbiosis; development; flowering; stress.

中图分类号：S565.1

文献标识码：A

通讯作者：夏正俊(1962-)，江苏建湖人，研究员，研究方向为大豆分子育种.

作者简介：第一张宇鹏(1991-)，男，山西晋中人，在读硕士，研究方向为大豆分子生物学.

基金项目：国家自然科学基金(31271742，31301338);科技部十二五科技支撑课题(2011BAD35B06-2).

收稿日期：2015-10-17；修回日期：2015-12-01.

文章编号:2095-2961(2016)01 -0048-06

doi:10.11689/j.issn.2095-2961.2016.01.007