黑蒜提取液对胰腺癌Panc－1细胞生长与抗氧化分子机制的实验研究＊

宫晓静，万玲琴，王义善

基础医学

黑蒜提取液对胰腺癌Panc－1细胞生长与抗氧化分子机制的实验研究＊

宫晓静，万玲琴，王义善＊

目的 探讨黑蒜提取液（aged black garlic extract，ABGE）对Panc－1细胞生长与抗氧化能力的影响。方法 将不同浓度的ABGE（0．2、1．0、1．8 mg／ml）作用于Panc－1细胞，采用CCK－8法分别于24 h、48 h、72 h测定Panc－1细胞株的生长能力；RT－PCR检测ABGE干预后Panc－1细胞VEGFmRNA以及MMP－9mRNA表达变化；ELISA法检测Panc－1细胞上清液中相关蛋白VEGF、SOD的表达情况。结果CCK－8结果显示，黑蒜提取液对Panc－1细胞株的生长活性具有明显的抑制作用，且具有时间剂量依赖关系；RT－PCR结果显示，黑蒜提取液能明显地上调VEGFmRNA以及下调MMP－9mRNA的表达；ELISA法结果显示，随黑蒜提取液浓度的增加，Panc－1细胞上清液中VEGF蛋白的表达水平下降、SOD蛋白表达增加。结论 黑蒜提取液能显著抑制Panc－1细胞的生长能力，其抗氧化能力可能是与下调VEGF蛋白表达、MMP－9以及上调SOD表达有关。

黑蒜提取液；Panc－1细胞；VEGF蛋白；SOD蛋白；细胞生长；抗氧化能力

胰腺癌是一种最为常见消化道恶性肿瘤，其发病率约占所有肿瘤的5%，近几年以来并有发病率持续上升的趋势，胰腺癌具有恶性程度极高，发展快，早期转移，治疗效果较差，并且死亡率较高的特点，因此能在早期诊断对于治疗胰腺癌有至关重要的作用［1］。随着分子生物学、细胞生物学的发展以及人们对胰腺癌发生发展的分子机制认识的加深，目前胰腺癌的研究逐步深入到分子机制水平［2］。本研究主要从细胞分子水平；来研究胰腺癌在生长增殖阶段的发生机制。而随着中国医学的发展，中医药对于肿瘤发生进展中作用日益发挥重要作用，诸多被研究证实具有较好的抗肿瘤，提高机体免疫力的作用，具有良好的发展前景。

黑蒜是将新鲜的大蒜在一定的温度湿度条件下经过一系列的加工工艺，并且保留了大蒜原有的活性有效成分，最大限度地发挥了其抗肿瘤的作用机制，且能较稳定地保存。黑蒜中含有三十多种化合物，其中主要有效成分为大蒜素。现代实验研究已经证实，黑蒜具有明显的抗肿瘤、抗氧化的作用［3］。本实验黑蒜提取液由中国人民解放军第107医院中心实验室提供，前期诸多实验已经证明黑蒜提取液能够对人胃癌SGC－7901、小鼠肝癌Hep－A22有抑制肿瘤生长和抗氧化的作用［4］。但是对胰腺癌的作用研究较少，本实验研究黑蒜提取液对胰腺癌Panc－1细胞生长增殖以及氧化作用的影响以及作用的分子机制，为后期的黑蒜运用于临床提供更多的理论实验依据。

1 材料与方法

1．1 试剂与仪器黑蒜购于大连华谷蒜业有限公司，剥外皮后将100 g果脯膏状黑蒜捣碎制成酱状，充分浸泡在95%1000 ml乙醇中24 h，后真空过滤重复多次，将滤液放于旋转蒸发仪上中，使其最终温度不超过47．5℃，最终将其浓缩到50 ml，用0．9% 50 ml生理盐水将其充分溶解，一般用0．22 μm滤膜过滤制成黑蒜提取液。相当于生药1 g／ml，放于4℃保存以备后续实验。DMEM高糖培养基、已灭活胎牛血清：美国Hyclone公司；胰蛋白酶：Amersco公司；DMSO：安徽安特化工有限公司；CCK－8试剂：碧云天生物公司；RNAiso Plus：大连TaKaRa公司；反转录试剂盒：大连TaKaRa公司；Realtime－PCR试剂盒：大连TaKaRa公司；小鼠抗人VEGF ELISA试剂盒、抗氧化SOD检测试剂盒购自碧云天生物公司。

1．2 细胞以及细胞处理人胰腺癌Panc－1细胞株购自中科院上海细胞库，将胰腺癌Panc－1细胞培养于含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 mg／L链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%的CO2的恒温培养箱中常规无菌培养，保持细胞单层贴壁生长，生长至80%～90%融合时将细胞用0．25%的胰蛋白酶消化后传代，取对数生长期的细胞做后续实验。

1．3 CCK－8法检测Panc－1细胞体外生长增殖活性选取对数生长期Panc－1细胞，轻轻反复吹打细胞悬液使之均匀后，以DMEM培养基调整细胞浓度至5×104／ml，轻轻反复吹打细胞悬液使之均匀后，加入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液100 μl，每组设3个复孔，同时设置空白对照组（0．1% DMSO），培养箱中培养24 h后细胞贴壁后，吸弃培养液，加入含有不同浓度的黑蒜提取液的DMEM培养基，使其终浓度分别为0．2、1．0、1．8 mg／ml，后继续培养24、48和72 h后取出培养板，每孔再加入10 μl CCK－8试剂，继续培养4 h后，用酶标仪在450 nm处测定每个孔的吸光度值（A值），计算细胞的生长抑制率。细胞生长抑制率＝（1－实验组A值／对照组A值）×100%。用SPSS13．0统计软件分析处理。

1．4 RT－PCR检测黑蒜提取液VEGFmRNA以及MMP－9mRNA的表达活性细胞以1．0×105个／ml的密度接种于25 ml培养瓶中，于37℃培养箱中无菌培养24 h，待细胞贴壁之后，选取0．2，1．0，1．8 mg／ml的黑蒜提取液浓度作用于细胞，24 h后收集对数生长期细胞，并设最终浓度0．1%PBS浓度为对照组，RNAiso Plus提取总RNA，核酸分析仪检测RNA纯度，OD260／OD280在1．9～2．1之间，纯度较好，反转录成cDNA后进行PCR反应。引物有青岛生物工程有限公司合成VEGFmRNA上游引物序列为：5'－GACTTGTGTTGGGAGGAGGA－3'，下游引物序列为 5'－TCTGGAAGTGAGCCAATG TG－3'；MMP－9mRNA上游引物序列为：5'－CTGGCG TGTGAGTTTCCAA－3'，下游引物序列为5'－CGGTT GAAGCAAAGAAGGAG－3'。反应体系的配制：SYBR Premix Ex Tap（2×）10 μl、PCR Reverse Primer（10 μmol／L）0．8 μL、DNA模板2．0 μl以及dH2O 7．2 μl共20 μl液体混匀，置于Real time－PCR扩增仪中，按照Real time－PCR反应程序：95℃30 s；PCR反应95℃ 5 s，60℃ 20 s，40 cycles；溶解曲线分析基因改变。

1．5 ELISA检测Panc－1细胞上清液VEGF、SOD含量细胞以1．0×105个／ml的密度接种于25 ml培养瓶中，于37℃培养箱中无菌培养24 h，待细胞贴壁之后，选取0．2、1．0、1．8 mg／ml的黑蒜提取液浓度作用于细胞，每组设3个复孔，孵育48 h后收集细胞上清液，依照ELISA试剂盒操作流程测定VEGF以及SOD蛋白的浓度。

1．6 统计学方法采用SPSS 13．0软件分析数据，各实验重复3次，两样本比较采用t检验，样本均数比较采用均数±标准差（±s）表示。以P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 CCK－8实验检测结果CCK－8实验检测结果显示黑蒜提取液对Panc－1细胞的生长增殖具有明显的抑制作用，并且随着黑蒜提取液浓度和反应时间的增加，Panc－1细胞生长力明显下降。选用不同浓度的黑蒜提取液（0．2，，1．0，1．8mg／ml）对Panc－1细胞24 h的生长抑制率（%）分别为9．53±1．31、25．7±3．02、42．45±2．88；48 h的细胞生长抑制率（%）分别为14．5±3．64、28．45±3．57、50．27±3．26；72 h的细胞生长抑制率（%）分别为16．79±3．26、30．58±3．27、55．64±5．42。明显看出随着黑蒜提取液浓度和反应时间的增加，Panc－1细胞的生长能力明显下降，与空白对照组具有显著性差异（P＜0．05）。见图1。

图1 黑蒜提取液不同浓度对Panc-1细胞生长抑制率的比较

2．2 RT－PCR检测结果经PCR实验检测后得到空白对照组及各黑蒜提取液实验组VEGFmRNA以及MMP－9mRNA表达结果显示，与空白对照组比较，经不同浓度黑蒜提取液24 h处理后的Panc－1细胞中VEGFmRNA以及MMP－9mRNA的含量均明显降低，且差异具有统计学意义（P＜0．05）。见表1，图2a、b。

表1 黑蒜提取液对Panc－1细胞相关基因mRNA表达的影响（±s，n＝3）

表1 黑蒜提取液对Panc－1细胞相关基因mRNA表达的影响（±s，n＝3）

注：与空白对照组比较，＊P＜0．05。

mRNA含量 空白对照组 黑蒜提取液0．2mg／ml组黑蒜提取液1．0mg／ml组黑蒜提取液1．8mg／ml组VEGF mRNA 1．09±0．10 0．77±0．02＊ 0．62±0．01＊ 0．45±0．01＊MMP－9mRNA 4．12±0．24 3．21±0．35＊ 2．11±0．04＊ 1．17±0．02＊

图2a 黑蒜提取液对Panc－1细胞VEGFmRNA表达的影响

图2b 黑蒜提取液对Panc－1细胞MMP－9mRNA表达的影响

2.3 ELISA法检测结果ELISA试剂盒检测结果显示，经不同浓度（0、0．2、1．0、1．8 mg／ml）黑蒜提取液作用于Panc－1细胞48 h之后，分别收集各组细胞上清液检测，各组上清液VEGF含量分别为0．98± 0．02 ng／ml、0．70±0．06 ng／ml、0．51±0．02 ng／ml、0．40± 0．04 ng／ml；各组上清液SOD蛋白含量分别为0．23± 0．03 ng／ml、0．45±0．02 ng／ml、0．62±0．01 ng／ml、0．78± 0．02 ng／ml。随着黑蒜提取液浓度的增加，VEGF含量呈下降趋势；SOD含量呈上升趋势，与空白对照组比较具有显著性差异（P＜0．05）。见图3、4。

图3 黑蒜提取液对Panc－1细胞上清液VEGF蛋白表达影响

图4 黑蒜提取液对Panc－1细胞上清液SOD蛋白表达影响

3 讨 论

黑蒜是指大蒜经过特殊加工工艺而制成的新型食药同用的中药材，其中大蒜素是主要活性成分，其中主要成分是二烯丙基三硫化物DATS，具有明显的杀菌消炎、抑制肿瘤细胞生长以及抗氧化的作用。本实验以黑蒜为研究，研究了黑蒜提取液作用于胰腺癌Panc－1细胞后细胞的生长活性以及抗氧化的机制。

肿瘤细胞生长与转移的一个主要条件是新生血管的生成。VEGF就是其中重要的促肿瘤血管生成因子，与肿瘤细胞的生长形成以及后期的转移恶化又有重要的联系［5］。前人已有研究证实［6］，黑蒜提取液中的有效成分大蒜素可以有效地抑制结肠癌HT29细胞的生长增殖。如果能做到有效地下调VEGF的含量表达，就可以有效地达到降低新生血管的形成，从而抑制肿瘤细胞的形成与生长［7］。而SOD（氧化物歧化酶）能够直接反映机体消除超氧基的能力，到达维持机体自由基产生与消除的平衡状态。VEGF表达的高低还对细胞基质的降解有重要的作用，研究证实能够有效下调VEGF，可以明显降低细胞外基质金属蛋白酶的含量［8］，本实验中以MMP－9为实验研究对象。当SOD含量下降时，机体的清除氧自由基的能力就会下降，造成氧离子蓄积，过多会相应地对细胞造成损伤，最终导致疾病的发生［9］。因此若能有效地调节VEGF以及SOD含量，将对肿瘤细胞的生长增殖产生关键作用。本实验研究中，黑蒜提取液能够显著地降低Panc－1细胞的生长增殖，并且具有时间及浓度依赖性关系；经不同浓度的黑蒜提取液处理的Panc－1细胞的VEGF以及SOD含量均有不同程度的下降和上升趋势。

经上所述，黑蒜提取液可以通过下调VEGF蛋白含量，以及下调MMP－9含量，上调SOD含量有效地抑制胰腺癌Panc－1细胞的生长能力，提高细胞的抗氧化能力。然而，其中的具体分子机制仍待解决研究。

［1］吕 楠，张宏艳．胰腺癌流行病学研究［J］．中国肿瘤临床，2007，34（23）：1368－1372．

［2］齐晓丽，田克丽，张典瑞，等．冬凌草甲素诱导胰腺癌PANC－1细胞凋亡及对G2／M细胞周期的阻滞作用［J］．山东大学学报：医学版，2011，49（2）：9－13．

［3］祝炳俏，吴海歌，刘媛媛，等．黑蒜抗氧化活性研究［J］．科学研究，2008，29（10）：58－60．

［4］王 鑫，杨 珂．黑蒜对肿瘤防治作用的研究进展［J］．实用医药杂志，2011，28（2）：176－178．

［5］Baker EA，Bergin FC，Leaper DJ．Plasminongen activator system，vascular endothelial growth factor，and colorectal cancer progression［J］．Mol Pathol，2010，53（3）：307－312．

［6］高 勇，刘扬清，曹维可．大蒜素抗结肠癌LOVO细胞侵袭转移作用及其机制［J］．中华医学杂志，2009，89（20）：1382－1386．

［7］Hosono T，HosnonFukao T，Inada K，et al．Alkenkl group is responsible for the disruption of microtubule network formation in human colon cancer line HT29 cells［J］．Carcinogenesis，2008，29（7）：1044－1406．

［8］刘德培．医学分子生物学［M］．北京：人民卫生出版社，2008：513－526．

［9］Hall TC，Dennison AR，Garcea G．The diagnosis and management of sphincter of Oddidys function：a systematic review［J］．Langenbecks Arch Surg，2012，397（6）：889－898．

［2015-10-19收稿，2015-11-17修回］

［本文编辑：韩仲琪］

Molecular mechanism ofaged black garlic extracton pancreatic cancer－1 cellgrowth and antioxidant ability：Experimental study

GONG Xiao－jing①，WAN Ling－qin，WANG Yi－shan.①
Binzhou Medical University，Yantai，Shandong 264003，China

ObjectiveTo explore molecular mechanism of aged black garlic extract（ABGE）on pancreatic cancer－1 cell growth and antioxidant ability．MethodsThe different concentrations of ABGE（0．2，1．0，1．8 mg／ml）acted as Panc－1 cell，the growth activity of Panc－1 was detected by CCK－8 at 24，48 and 72 h；the VEGF and SOD in supernatant of Panc－1 was detected by ELISA method；and the VEGFmRNA and MMP－9mRNA protein expression of Panc－1 was detected by Real-time－PCR．ResultsCCK－8 test showed that ABGE had the inhibitory effect on Panc－1 and in a time－dose－dependent manner；ELISA method showed that down－regulating VEGF and up－regulating SOD protein expression；Real-time－PCR test showed that ABGE could obviously downregulate VEGF and MMP－9 protein expression.Conclusion Aged black garlic extract can significantly inhibit pancreatic cancer－1 cell growth and tranfer，which may be the cause ABGE could interfere TGF－β1／Smad4 signaling pathway．

Aged black garlic extract；Pancreaticcancer－1；VEGF；SOD protein；Cell growth；Antioxidant ability

R735.9

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.04.018

全军科技攻关项目（06G034）

264003山东烟台，滨州医学院（宫晓静，万玲琴，王义善）；264002山东烟台，解放军107医院全军肿瘤重点治疗及无创诊疗中心（王义善）

王义善，Email：wangyishan288＠163．com