辣椒CaCBF1A基因的克隆及非生物胁迫下表达分析

魏小春，李 艳，姚秋菊，原玉香，赵艳艳，王志勇，姜 俊，段俊枝，蒋武生，张晓伟*

(1.河南省农业科学院 园艺研究所，河南 郑州 450002； 2.驻马店市农业科学院，河南 驻马店 463000；3.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002)



辣椒CaCBF1A基因的克隆及非生物胁迫下表达分析

魏小春1，李 艳2，姚秋菊1，原玉香1，赵艳艳1，王志勇1，姜 俊2，段俊枝3，蒋武生1，张晓伟1*

(1.河南省农业科学院 园艺研究所，河南 郑州 450002； 2.驻马店市农业科学院，河南 驻马店 463000；3.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002)

为揭示CaCBF1A基因在辣椒抗逆机制中发挥的功能，对辣椒CaCBF1A基因进行克隆与分析。以豫椒101为材料，根据参考基因组序列设计引物，通过PCR技术从辣椒基因组cDNA中获得CBF基因CaCBF1A。经生物信息学分析，该基因具有一个完整的ORF(471 bp)，编码156个氨基酸。CaCBF1A编码的蛋白质包含保守的AP2 DNA结合域。对其亚细胞定位、跨膜结构进行分析，预测其定位在叶绿体中，存在跨膜结构。荧光定量PCR检测结果表明，低温、高温和盐胁迫均可诱导CaCBF1A基因的表达，其表达量在迅速达到峰值后又降低，说明CaCBF1A是一个逆境胁迫快速响应基因，推测其在辣椒抗逆机制中起着重要的作用。

辣椒； CBF基因； 基因克隆； 非生物胁迫； 表达分析

辣椒(CapsicumannuumL.)原产于中南美洲热带雨林地区的墨西哥、秘鲁等地，属茄科辣椒属植物，果实内含有丰富的维生素C、糖类和辣椒素等营养物质。辣椒在我国各地普遍栽培，但在整个生育过程中，从播种到果实收获，其会时时刻刻受到干旱、低温、高温等非生物胁迫，轻者使植物生长发育受阻，重者导致植株死亡。

植物在应对非生物胁迫的过程中通常会发生一系列的生理生化反应，并且形成了一定的胁迫防御机制[1]，胁迫防御机制主要是通过防御反应基因的转录激活与抑制发生作用的[2]。在防御反应基因的转录调控中，转录因子起着重要的作用。转录因子通过转录调控功能区域与基因启动子区域中的顺式作用元件结合，从而来调控基因的表达。当然，一些转录因子其自身也受诱导调控，改变特定转录因子的表达条件会使植物的胁迫抗性发生很大变化[3]。CBF基因属于AP2/EREBP基因家族，是一种受逆境特异诱导表达的转录因子，可激活下游多个效应基因的表达，从而提高植物对低温、干旱等多种逆境胁迫的抗性[4-5]。

1 材料和方法

1.1 材料

辣椒材料豫椒101，由河南省农业科学院园艺研究所蔬菜育种课题组繁育。完全营养液为霍格兰-阿农配方。基质有机质、速效氮、速效钾、速效磷的含量分别为219 g/kg、1.765 9 g/kg、1.730 g/kg、0.093 6 g/kg，pH值为5.46。

1.2 方法

1.2.1 辣椒苗的准备 供试辣椒种子用纱布包好，先在55 ℃的热水中温汤浸种20 min，然后室温条件下充分吸水6～8 h，播于营养钵(6 cm×8 cm)中，每穴1～2粒种子。待子叶出土后放于光照强度为300～600 μmol/(m2·s)的培养架上进行培养，生长温度控制在25 ℃/18 ℃(昼/夜)，出苗后浇1/2营养液，每钵留壮苗1株，长至四叶一心时转苗至大营养钵(10 cm×10 cm)中。当幼苗第5片真叶展开时移入人工气候箱进行处理。

1.2.2 材料处理 低温处理：当植株6～8片真叶展平时，将穴盘放入预先降温到4 ℃(昼)/0 ℃(夜)的光照培养箱内进行低温处理，光照强度为160 μmol/(m2·s)、光周期为12 h光/12 h暗。高温处理：当植株6～8片真叶展平时进行高温处理，控制昼/夜温度为(45±2)℃/(35±2)℃。盐处理：设置CK (不加NaCl)和加NaCl 200 mmol/L 2个处理。每个处理重复3次，每个重复10株。每处理的材料数30株，未处理材料为对照。处理时间为0、6、12、24、48、96 h。取样后立即浸入液氮中，并放入-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2.3 辣椒总RNA提取和cDNA第一链合成 总RNA的提取采用TRIZOL法(USA)。cDNA第一链合成采用Thermo Scientific公司cDNA合成试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。

上面一听就乐了，非常满意，认为它比批斗更能触及灵魂。农民诗人李锦文听说吗？发表过很多打油诗，当年在省里影响蛮大，自嘲“李打油”，他得知此事蛮恼火，仗着认识几个上面的人，就要为我父亲去伸张正义。何止斯文扫地呀，斯文竟然去猪圈爬骚打花啦！我父亲在村口堵住他说：我李家自古崇文重教，把六十岁以上老者叫作老成，高中以上学历叫斯文，在祠堂里敬祖、喝酒，老成、斯文站前排、坐上席，这是秩序，也是风尚。叫我牵猪牯当花博士，好啊，你二伯妙招呀，你想想受辱的到底是哪个。

1.2.4 基因引物设计与合成 根据辣椒基因组数据库(http://peppergenome.snu.ac.kr/)中CBF基因(CA03g15650)的序列，在5′UTR及3′UTR设计引物(表1)，委托Invitrogen生物工程技术服务有限公司合成。

表1 辣椒CaCBF1A基因克隆及其表达检测所用引物

1.2.5CaCBF1A基因cDNA全长克隆 以第一链cDNA为模板，用CBF基因引物进行PCR扩增。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，反应35个循环。

PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，回收片段与pMD19-T载体(TaKaRa公司)连接，热击法转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性单克隆送公司测序，得到目的片段序列。PCR酶试剂(SeqAmpTMDNA Polymerase)购自Clontech公司，Marker DL2000购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2.6 序列分析 利用ClustalX 2软件对克隆的CaCBF1A基因的核苷酸及其编码氨基酸序列与其他物种的对应序列进行比对分析；根据所得的cDNA序列，利用NCBI的Blastp分析工具对基因所编码的氨基酸进行同源序列比对，并结合MEGA 4.0构建进化树；利用软件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)对CaCBF1A基因编码的氨基酸组分、分子量和等电点进行分析；利用软件ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸序列的亲/疏水性；利用软件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)对蛋白质二级结构进行预测；利用软件BaCelLo(http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)进行亚细胞定位的预测。

1.2.7 实时荧光定量分析 对上述高温、低温及盐胁迫处理后的辣椒叶片提取总RNA，反转录成cDNA。定量PCR反应体系为20.0 μL，含有10.0 μL 2×SYBR®Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)，2.0 μL cDNA，上、下游引物(qCBFF135及qCBFR339)各1 μL(引物浓度10 μmol/L)，6 μL ddH2O。运行程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40次循环。每个样品重复3次。

以Actin基因为内参，扩增引物为cACTINF228和cACTINR384。实时荧光定量PCR仪为罗氏公司LightCycler®96。采用2-△△CT法计算基因相对表达量[6]。

2 结果与分析

2.1 辣椒CaCBF1A基因的克隆

以辣椒cDNA第1条链为模板，用引物CBFF/CBFR扩增出600 bp左右的目的片段(图1)，将目的片段回收后连接转化，挑取阳性克隆用引物检测后测序。测序结果显示，该片段与辣椒基因组数据库中目的片段完全一致，大小为596 bp，该基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG具有一个完整的ORF(471 bp)，编码156个氨基酸。

M.DL2000

2.2 辣椒CaCBF1A基因编码氨基酸序列的同源性分析

对辣椒CaCBF1A基因编码的氨基酸序列在NCBI中进行Blastp比对分析，结果显示其蛋白质含有AP2/EREBP基因家族保守的AP2 DNA结合域(图2)。将辣椒CaCBF1A基因编码的氨基酸序列与其他物种的CBF基因编码的氨基酸序列进行比对，结果表明，辣椒CBF1A氨基酸与其他作物CBF氨基酸有高度的相似性，属于CBF家族(图3)。

图2 CaCBF1A基因编码蛋白的保守结构域分析

图3 辣椒CaCBF1A编码氨基酸序列与其他作物CBF编码氨基酸序列比对

2.3 辣椒CaCBF1A蛋白理化性质的预测

利用ProtParam软件预测辣椒CaCBF1A蛋白分子质量为17.058 ku，理论等电点为4.29，分子式为C765H1153N191O236S8。该蛋白质中含量最高的氨基酸为Ser，相对含量达到了12.2%，含量较低的氨基酸有Cys、His和Trp，共计为1.2%，不含有Pyl和Sec。其脂肪系数为77.63，疏水性平均值为0.043。说明该蛋白质为疏水性蛋白。

2.4 辣椒CaCBF1A蛋白亚细胞定位、二级结构及疏水性分析

利用BaCelLo软件对辣椒CaCBF1A进行亚细胞定位的预测，结果表明其定位在叶绿体中(图4)。

蛋白质的多肽链通过折叠、螺旋和卷曲等二级结构形成比较稳定的空间结构，利用软件分析CaCBF1A的二级结构，发现多个氨基酸参与α-螺旋、无规则卷曲和延伸链等二级结构的形成，其中α-螺旋、延伸链、β-折叠和无规则卷曲分别占42.95%、12.18%、7.05%和37.82%(图5)。这4个结构是构成CaCBF1A蛋白的基本结构。

图4 辣椒CaCBF1A蛋白亚细胞定位预测

h、e、t和c分别代表α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲

采用ProtScale对CaCBF1A蛋白的疏水性进行分析(图6)，整体来看，亲水性氨基酸和疏水性氨基酸在整个蛋白质中分布不均匀，有明显的疏水区。

2.5 辣椒CaCBF1A蛋白进化树分析

使用NCBI中Blastp工具对辣椒CaCBF1A氨基酸序列进行同源性检索，对检索到的数据再利用MEGA 4.0软件构建系统进化树。结果表明，辣椒CaCBF1A与茄属(Solanum)植物CBF1亲缘关系最近，而与杨属(Populus)、葡萄属(Vitis)植物等亲缘关系较远(图7)。

图6 辣椒CaCBF1A蛋白亲疏水性预测

图7 辣椒及其他物种CBF蛋白进化树分析

2.6 辣椒CaCBF1A基因在不同逆境胁迫下的表达分析

利用荧光定量PCR仪分别检测辣椒CaCBF1A在低温胁迫、高温胁迫和盐胁迫下的相对表达量。结果表明，CaCBF1A基因在低温胁迫后表达量迅速升高后又下降，在12 h时表达量迅速达到峰值，约为对照的135倍，24 h后仅为对照的28倍(图8a)；CaCBF1A基因在高温胁迫12 h后表达量迅速升为对照的172倍，在24 h时迅速恢复正常，总体上表达量先逐渐升高达到峰值后下降，随着处理时间的延长又呈逐渐上升的趋势(图8b)；CaCBF1A基因在盐胁迫后表达量逐渐升高后又逐渐下降，在盐胁迫12 h时表达量达到峰值，约为对照的20倍(图8c)。

图8 逆境胁迫下CaCBF1A基因在叶片中的表达情况

3 结论与讨论

AP2/EREBP是一种受逆境特异诱导的转录因子，可激活下游多个效应基因的表达[4]。CBF基因属于AP2/EREBP基因家族，具有AP2 DNA结合域，该结合域是植物基因特有的结合域[7]。CRT/DRE是高等植物抗逆相关基因中的一种顺式作用因子，CBF基因中的AP2 DNA结合域能够识别CRT/DRE顺式作用元件，并调控抗逆相关功能基因的表达，从而提高植物对环境的耐受性。

Medina等[8]研究发现，拟南芥CBF基因家族成员AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因只对低温产生了响应，对干旱和ABA没有反应。对辣椒CaCBF1A和CaCBF1B研究发现，低温情况下，这2个基因受诱导表达；而如果长期持续低温，这2个基因会一直表达，CaCBF1A上调10～15倍[9]。

秦红霞等[10]研究了银新杨转录因子PaDREB2的表达模式，发现其表达受低温、干旱和盐胁迫的诱导。通过转录组分析及突变试验研究低温胁迫下拟南芥基因表达情况，结果表明，CBF2能够诱导44个基因上调，其中有25个基因至少上调15倍[11]。Wang等[12]研究柠条锦鸡儿CkCBF基因，发现其在低温、干旱、高盐及ABA等逆境条件下表达量上调；在烟草中超量表达该基因，与非转基因植株相比，其提高了植株的耐盐性和渗透力。周洲等[13]对毛白杨转录因子PtCBF5在逆境下的表达模式进行分析发现，其在低温和干旱胁迫下表达量有显著变化，而对高盐和ABA胁迫没有反应。将甜椒(Capsicumfrutescens)CfCBF3基因转到烟草中，结果表明，在冷胁迫下，CfCBF3急速上调；而在盐胁迫及干旱胁迫下，该基因诱导差异不显著[14]。将南极发草DaCBF7基因转到水稻中，逆境胁迫后分析表明，该基因大大提升了转基因植株耐低温胁迫能力，而对干旱及盐胁迫作用不大[15]。

本试验通过同源克隆的方法从辣椒基因组中克隆到CaCBF1A基因(CA03g15650)，并利用生物信息学软件对其编码氨基酸序列进行了分析，该基因具有一个完整的ORF(471 bp)，编码156个氨基酸。CaCBF1A编码的蛋白质包含保守的AP2 DNA结合域。对其亚细胞定位、跨膜结构进行分析，预测其定位在叶绿体中，存在跨膜结构。进一步研究了辣椒CaCBF1A基因对低温胁迫、高温胁迫和盐胁迫的响应。对胁迫环境下其相对表达量的分析表明，随着胁迫处理时间的延长，其表达量呈现先升高后下降的趋势。由于CBF转录因子在许多与抗逆相关功能基因的表达中发挥重要作用，因此，利用CBF基因增强植物抗逆性成为改良植物的重要途径。

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Cloning and Expression Analysis ofCaCBF1AGene fromCapsicumannuumL.under Abiotic Stress

WEI Xiaochun1,LI Yan2,YAO Qiuju1,YUAN Yuxiang1,ZHAO Yanyan1,WANG Zhiyong1,JIANG Jun2,DUAN Junzhi3,JIANG Wusheng1,ZHANG Xiaowei1*

(1.Institute of Horticulture,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 2.Zhumadian Institute of Agricultural Sciences,Zhumadian 463000,China;3.Institute of Agricultural Economy and Information,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

To reveal the roles ofCaCBF1Agene played in pepper,theCaCBF1Agene was cloned and analyzed.According to the CBF gene sequence fromCapsicumannuumgenome,the primer was designed.Yujiao 101 was taken as material andCaCBF1Awas acquired from the genome of pepper by PCR.The bioinformatics analysis results indicated that the gene possessed complete ORF with length of 471 bp,encoding 156 amino acids.Protein encoded byCaCBF1Agene in pepper contained conservative AP2 DNA binding domain.Besides,the subcellular localization and membrane structure were analyzed.It was predicted that protein encoded byCaCBF1Awas located in chloroplasts,and contained transmembrane structure.Furthermore,the results by fluorescence quantitative PCR showed that cold,high temperature and salt stress could induce the expression ofCaCBF1Agene,the expression level of which was decreased rapidly after peak point.These could provide some indication thatCaCBF1Awas rapid response gene,which played important roles in the resistance mechanisms of pepper.

CapsicumannuumL.; CBF gene; gene cloning; abiotic stress; expression analysis

2016-07-20

国家大宗蔬菜产业技术体系豫北综合试验站项目(CARS-25-G-27)；河南省重大科技专项(151100110400)

魏小春(1983-)，男，河南项城人，助理研究员，博士，主要从事植物生理与分子生物学研究。 E-mail:jweixiaochun@126.com

*通讯作者：张晓伟(1965-)，男，河南平舆人，研究员，硕士，主要从事蔬菜育种与分子生物学研究。

时间：2016-11-25 14∶24∶33

S641.3

A

1004-3268(2016)12-0110-06

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.028.html