厚朴内生真菌HPFJ3菌丝体中抑菌活性物质的分离纯化及结构鉴定

姜华年

(丽水学院 生态学院，浙江 丽水 323000)



厚朴内生真菌HPFJ3菌丝体中抑菌活性物质的分离纯化及结构鉴定

姜华年

(丽水学院 生态学院，浙江 丽水 323000)

为了促进厚朴内生真菌资源的开发利用，以一株对小麦全蚀病菌具有较高抑菌活性的厚朴内生真菌黑孢霉HPFJ3菌株(Nigrosporasp.HPFJ3)为研究材料，对发酵菌丝体甲醇粗提物中能够抑制植物病原菌生长的活性物质进行分析。通过活性指导下的色谱分离，从甲醇提取物中得到3种化合物，质谱(MS)和核磁共振波谱(NMR)鉴定结果表明，3种化合物分别为麦角甾醇、对羟基苯甲酸以及4-羟基-18碳酸。活性检测试验显示，麦角甾醇和对羟基苯甲酸2种化合物对小麦全蚀病菌均具有生长抑制作用，且麦角甾醇的抑菌活性较强，抑菌率达到66.70%；而4-羟基-18碳酸对小麦全蚀病菌无生长抑制作用。

内生真菌； 黑孢霉； 小麦全蚀病菌； 化学成分； 结构鉴定； 抑菌活性

由禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)侵染小麦引起的全蚀病(wheat take-all)是一种重要的小麦根部病害[1]，主要危害小麦的根部和茎基部，在我国主要小麦产区均有广泛发生，严重制约小麦产量和品质性状的提高。目前,主要是利用化学药剂防治该病,然而化学农药在使用过程中容易引起环境污染、药害、农产品农药残留超标、农田生态平衡和生物多样性被破坏等问题[2]。因此生物防治逐步发展成为小麦全蚀病的重要绿色防控技术。

植物内生菌(endophytic fungus) 是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物的各组织和器官内部，并不引起植物组织产生明显病害症状的微生物[3]。内生菌能够与寄主植物协同进化，形成互惠共生的关系，研究表明,植物内生菌及其次生代谢产物不但可以促进寄主植物的生长发育，且能够提高植物抗逆、抗病等方面的能力[4-7]，是筛选开发新型微生物源农药或增产菌剂的重要资源。目前，关于植物内生菌的研究主要集中在药用植物[8]、农作物[9]以及特殊生境植物[10]等，其中从药用植物内生菌代谢产物中寻找新型活性物质，仍是当前内生菌研究的主流之一[8,11-12]。厚朴(Magnoliaofficinalis)属于木兰科木兰属乔木，为我国特有的经济树种。相关研究表明，厚朴的化学成分主要为厚朴酚、槲皮苷、生物碱等，这些化学成分在医学上具有抗菌、消炎、镇痛等作用，因此，厚朴拥有较大的应用价值和开发价值[13-14]。丽水学院生态学院植物学课题组前期自厚朴健康茎组织中分离到一株内生真菌HPFJ3，其在离体条件下对小麦全蚀病菌具有较高抑菌活性，本试验通过抑菌活性指导下的色谱分离技术，对该菌株发酵菌丝体的甲醇粗提物进行分离、纯化、鉴定，以期发现具有抑制植物病原菌活性的化合物，为后续进行微生物源农药的开发奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 生防菌HPFJ3为丽水学院生态学院植物学课题组分离自厚朴健康茎组织中的一株内生真菌，在离体条件下对小麦全蚀病菌具有较高抑菌活性，经鉴定其属于黑孢霉属(Nigrospora)真菌(NCBI登录号：KP795394)。

抑菌活性测试菌株为小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)，由丽水学院生态学院植物学课题组保存。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g、水1 000 mL，pH值自然。121 ℃灭菌20 min。

马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL、pH值自然。121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 仪器和试剂 主要仪器：SENCO R-502B型旋转蒸发器由上海申胜生物技术公司生产；SIGMA3K30 高速台式冷冻离心机由北京博励行仪器有限公司生产；高效液相色谱仪(SP930D高压泵、UV730D检测器、Autochro2000色谱工作站、SDV30混合器)由韩国YOUNGLIN公司生产；分析柱ODS2C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、制备柱ODS2C18(20 mm×250 mm，5 μm)均为美国Waters公司生产；HPLC-MS、ESI 离子源(6210 Time of Flight LC/MS)均为美国Agilent公司生产；核磁共振仪(400 MHz)由美国BRUKER公司生产。

主要试剂：柱层析硅胶(70～150 μm)由中国医药集团上海化学试剂公司生产；GF254高效薄层硅胶板由青岛海洋化工厂分厂生产；色谱纯甲醇、色谱纯乙腈由江苏恒安试剂公司生产；分析纯乙酸乙酯、分析纯甲醇及分析纯石油醚均为上海一试化学试剂有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 厚朴内生真菌HPFJ3的发酵及甲醇粗提物制备 种子液制备：将HPFJ3菌株接种至装有100 mL马铃薯葡萄糖液体培养基的250 mL 锥形瓶中，在(26±2)℃、150 r/min 条件下摇床培养4～5 d，获得种子液；发酵产物制备：相同条件下，将种子液分别转接到装有300 mL马铃薯葡萄糖液体培养基的1 000 mL 锥形瓶中，摇床培养7 d，共获得发酵产物30 L。

菌株HPFJ3的发酵产物经离心机离心、过滤，分别得到发酵液和菌丝体。将菌丝体冷冻干燥至恒质量后称质量，在固液比1∶5、40～50 ℃ 的条件下，依次用分析纯甲醇浸提3次，每次8～10 h，浸提液于50 ℃真空浓缩蒸干，得浸膏6.48 g，即为HPFJ3 菌丝体的甲醇粗提物。

1.2.2 厚朴内生真菌HPFJ3甲醇粗提物的分离与纯化 将HPFJ3 菌丝体的甲醇提取物(6.48 g)用适量甲醇溶解后，用薄层层析硅胶H60(15 g)拌样，石油醚饱和薄层层析硅胶H60装柱(层析柱直径4.5 cm、高100 cm)，利用柱层析技术对甲醇提取物进行初步分离纯化，分离过程中利用石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇洗脱系统进行梯度洗脱，自动收集，逐管点样进行薄层分析(展开剂为乙酸乙酯∶甲醇=10∶1，显色剂为硫酸-水溶液和碘化铋钾试剂)[15]，最终得到10个组分。

1.2.3 10个组分的抑菌活性检测 将10个不同组分低温浓缩称质量，分别取样品若干，用无菌水配制成 2 mg/mL的母液。吸取10个不同组分的母液各500 μL于无菌培养皿(直径9 cm)内，与10 mL PDA培养基迅速混匀,制成混合平板，以加入无菌水为空白对照。采用菌丝生长速率法[16-18]对10个不同组分进行抑菌活性检测，处理组和空白对照组各设3个重复，25 ℃恒温培养，待空白对照满皿后，用十字交叉法测量处理组菌落直径。处理组对小麦全蚀病菌菌丝生长的抑制率按如下公式计算：菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

1.2.4 活性组分抑菌物质的分离纯化和结构鉴定

1.2.4.1 活性组分5中抑菌物质分离纯化 将活性组分5配制成约1 mg/mL的样品溶液，进行高效液相色谱(HPLC)分析，以甲醇0～100%、水100%～0的梯度进行梯度洗脱，洗脱速度为1 mL/min，洗脱时间30 min。二极管阵列检测器(DAD)检测波长为200～400 nm。

根据活性组分5的HPLC分析结果，将活性组分5溶于甲醇中，配成50 mg/mL的质量浓度，进样0.8 mL，进行样品制备。制备柱为Waters ODS2反相C18，规格为20 mm×250 mm，粒径5 μm；流动相：0～5 min 100%水，5～15 min 20%甲醇，15～25 min 40%甲醇，25～40 min 60%甲醇，40～60 min 80%甲醇，60～80 min 100%甲醇。洗脱速度15 mL/min，检测波长210 nm。80%甲醇梯度洗脱得化合物1 。

1.2.4.2 活性组分8中抑菌物质分离纯化 将活性组分8配制成约1 mg/mL的样品溶液，进行HPLC分析，以甲醇0～100%、水100%～0的梯度进行梯度洗脱，洗脱速度为1 mL/min，洗脱时间40 min。DAD检测波长为200～400 nm。

根据活性组分8的HPLC分析结果，将活性组分8溶于甲醇中，配成125 mg/mL的质量浓度，进样0.6 mL，进行样品制备。制备柱为Waters ODS2反相C18，规格为20 mm×250 mm，粒径5 μm；流动相：0～10 min 100%水，10～20 min 20%甲醇，20～25 min 40%甲醇，25～40 min 60%甲醇，40～60 min 100%甲醇。洗脱速度15 mL/min，检测波长260 nm。分别于20%甲醇和100%甲醇梯度下洗脱得化合物2和化合物3 。

1.2.4.3 化合物的结构鉴定 借助液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、核磁共振波谱分析(1H-NMR、13C-NMR)等技术对获得的化合物进行结构鉴定。

1.2.5 3种化合物的抑菌活性检测

采用菌丝生长速率法检测3种化合物对小麦全蚀病菌生长的抑制作用。3种化合物分别用无菌水配制成 0.5 mg/mL的母液，接下来的操作同1.2.3。设置无菌水为空白对照，75%多菌灵可湿性粉剂(购自江苏省江阴农药厂)稀释800倍液为阳性对照。25 ℃恒温培养，待空白对照长满皿后，用十字交叉法测量处理组菌落直径，计算3种化合物对小麦全蚀病菌菌丝生长的抑制率。

2 结果与分析

2.1 厚朴内生真菌HPFJ3甲醇粗提物的分离纯化结果

本研究利用常压硅胶柱色谱、高效液相色谱等技术对厚朴内生真菌HPFJ3甲醇粗提物以及活性化合物进行分离、纯化和制备。

2.1.1 活性组分的初步分离 对厚朴内生真菌HPFJ3甲醇粗提物过柱后的10个组分进行抑菌活性测定，发现小麦全蚀病菌可在含组分1、组分2以及组分10的培养基上生长，说明这3个组分对小麦全蚀病菌的生长无抑制作用；其余7个组分中，组分5和组分8有较好的抑菌活性，其在0.1 mg/mL的质量浓度下对小麦全蚀病菌的生长抑制率分别达到44.62%、33.52%(表1)。在后续试验中，对上述2个组分进行分离纯化，以期得到具有抑菌活性的化合物单体。

表1 甲醇粗提物过柱后的10个组分对小麦全蚀病菌的抑菌活性

2.1.2 活性组分的分离纯化 利用甲醇-水梯度洗脱法对活性组分5和组分8 分别进行分离纯化，共得到3种化合物，色谱分析发现此3种化合物在洗脱过程中均仅有1个主峰出现，试管收集主峰，进一步的高效薄层色谱分析(HPTLC)和HPLC分析均表明主峰为纯化合物，制备收集化合物，经脱溶、真空冷冻干燥最终得到化合物1(12.6 mg)、化合物2(6.3 mg)和化合物3(11.4 mg)。

2.2 3种化合物的结构鉴定结果

2.2.1 化合物1

2.2.1.1 质谱分析 取纯化后的冻干粉配制成0.1 mg/mL的甲醇溶液进行HPLC-MS分析。结果显示，阳离子模式M/Z：397.297 5(M+H)+峰(图1)。由于化合物1的分子量和氢分子量的和为397，可知化合物1的分子量为396，可能分子式为C28H44O。

图1 化合物1的质谱分析(+Q)

利用Chapman & Hall天然产物数据库检索分子量为396的相关化合物，发现麦角甾醇(9-glucopyranosyl theophylline)的分子量为396；此外，麦角甾醇为白色粉末状化合物，与本研究得到的化合物1物理性状一致。因此，初步推断化合物1可能为麦角甾醇。

2.2.1.2 核磁共振波谱分析(NMR) 为进一步证实前面的推断，本研究继续用NMR进行分析。1H图谱(图2)显示该化合物具有典型的甾醇类化合物特征，经与标准谱对照，发现该图谱与麦角甾醇的图谱一致，在此基础上又进行了碳谱(图3)及DEPT 135图谱(图4)分析。13C谱给出了28个碳的信号，而DEPT 135 图谱表明该化合物有多个CH2和处于环交接处的CH峰，因此，结合13C谱与DEPT 135 图谱分析可知，该化合物有5个季碳、6个甲基、7个亚甲基、10个次甲基，其中6个不饱和碳分别为甾醇的5、6、7、8、22、23位的碳原子，位移值为70.35的是接羟基的碳原子，这些与麦角甾醇完全一致。结合质谱、氢谱以及碳谱，可知此化合物为麦角甾醇(图5)。

图2 化合物1的核磁共振氢谱

图3 化合物1的核磁共振碳谱

图4 化合物1的DEPT 135 图谱

图5 麦角甾醇结构

2.2.2 化合物2

2.2.2.1 质谱分析 质谱分析表明，该化合物阴离子流信号较强，而阳离子流信号相对较弱，说明该化合物可能是一种偏酸性的化合物。阴离子模式M/Z：137.0254(M-H)峰、93.0362(M-COOH)峰(图6)；阳离子模式M/Z：139.0507(M+H) 峰(图7)。由此可知，化合物2的分子量为138，含有1个羧基，可能分子式为C7H6O3。

图6 化合物2的质谱分析(-Q)

图7 化合物2的质谱分析(+Q)

利用Chapman & Hall天然产物数据库检索分子量为138的相关化合物，发现目前报道的对羟基苯甲酸的分子量恰好是138，因此，可初步推断化合物2为对羟基苯甲酸。

2.2.2.21H核磁共振图谱分析 该化合物在位移值为6.8和7.8处有2个相互偶合的峰，偶合常数为8.2左右，可能是苯环对位取代后2组相互偶合的氢，也可能是苯环上2个偶位偶合的氢(图8)。结合质谱分析结果(该化合物含有1个羧基)，可知该化合物为对羟基苯甲酸，结构式见图9。

图8 化合物2的核磁共振氢谱

图9 对羟基苯甲酸结构

2.2.3 化合物3

2.2.3.1 质谱分析 化合物3的阳离子图谱如图10，结合其碳谱(图11)及氢谱(图12)，可分析推断M/Z=323.2为化合物3的M+Na+峰，而相对于323.2的其他峰M/Z=274.4、M/Z=246.3等均为杂质峰，化合物3的分子量为300.0，分子式可能为C18H36O3，且不饱和度=1。

图10 化合物3的质谱分析(+Q)

图11 化合物3的核磁共振碳谱

图12 化合物3的核磁共振氢谱

2.2.3.2 NMR分析 化合物3的碳谱(图11)显示，在δ=179.377 ppm处有1个羧基碳，说明此化合物为羧酸类物质，其含有的3个氧中有2个属于羧酸，而δ=72.093 ppm处有一连杂原子的碳，因此可推断出δ=72.093 ppm处的碳必然连有羟基。在此化合物的13C图谱上可明显看到，δ=14.092 ppm处有一甲基碳，δ22～δ37之间恰好是16个脂肪碳。此外，由碳谱上可观察到有3个碳信号峰(δ31～δ37)偏向低场，它们可能是靠近羧基和羟基，而另外3个偏向较高场的碳信号峰(δ14～δ24)应是末端甲基和亚甲基，中间信号较相近的则是脂肪烃的中间重复的亚甲基。推断该化合物可能是4-羟基-18碳酸。

在该化合物的氢谱(图12)上可看到典型的脂肪烃的特征，从氢的总数上来看，氢的总数为30，少于分子式中的36，此结果可能与测试仪器存在的误差有关。从δ=3.5 ppm的大致位移来看，可能是羟基氢的位移值，此分析结果与碳谱推断的结果一致。而且图中δ=2.3 ppm处的3重峰是临近羰基碳的氢，而δ=1.6 ppm处的则为临近连羟基碳的氢，此推论与前面估计羟基在4位的推断一致。通过对化合物3的核磁共振分析，可知此化合物为4-羟基-18碳酸，结构式见图13。

图13 4-羟基-18碳酸结构

2.3 3种化合物的抑菌活性

从表2可看出，化合物4-羟基-18碳酸对小麦全蚀病菌的生长无抑制作用，全蚀病菌可以在含有4-羟基-18碳酸的培养基上生长；麦角甾醇和对羟基苯甲酸均对小麦全蚀病菌的生长有抑制作用(图14)，其中麦角甾醇对小麦全蚀病菌的抑制作用最强，达66.70%，与阳性对照多菌灵溶液对小麦全蚀病菌的抑制率(68.09%)相当。

表2 3种化合物对小麦全蚀病菌的抑菌活性

注：表中所列数据为3个重复的平均值，同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

A.无菌水(阴性对照)；B.麦角甾醇；C.对羟基苯甲酸；D.75%多菌灵可湿性粉剂800倍液(阳性对照)

3 结论与讨论

本研究从厚朴内生黑孢霉HPFJ3液体发酵产物菌丝体的甲醇提取物中分离鉴定了3个化合物，分别为麦角甾醇、对羟基苯甲酸、4-羟基-18碳酸。黑孢霉属(Nigrospora)真菌在多种植物体内广泛存在[19-21]，能够产生多种活性代谢产物， 如从药用植物红豆杉中分离得到的内生黑孢霉菌株能产生紫杉醇[19]，从一种蕨类植物分离的稻黑孢霉可产生具有抗细菌活性的蒽醌类化合物卷线孢菌素[22]，且卷线孢菌素已作为重要的生防化合物应用于植物病害的防治。本试验中，对上述3种化合物进行抑菌活性测试发现，麦角甾醇、对羟基苯甲酸对小麦全蚀病菌具有抑菌活性，且麦角甾醇的抑菌活性较显著，对小麦全蚀病菌的抑菌率达到66.70%。相关研究报道[23]，麦角甾醇大量存在于食药用菌中，是微生物细胞膜的重要组成部分，也是一种极其重要的医药化工原料，可以用来生产黄体酮、可的松等药物。本试验首次发现麦角甾醇对小麦全蚀病菌有较强的抑菌作用，产生这一现象可能是因为麦角甾醇在和植物病原真菌互作的过程中形成氧化产物-麦角甾醇过氧化物，这种过氧化物具有促进肿瘤细胞凋亡、抗炎、抗氧化等药理作用[24-26]，从而在一定程度上抑制小麦全蚀病菌的生长。该推测有待于进一步的研究证明。

黑孢霉属真菌能够产生比较丰富的生物活性物质，是发现活性代谢产物的主要真菌类群之一[19-22]。本试验表明，厚朴内生黑孢霉HPFJ3 发酵菌丝体含有具抑菌活性的化合物麦角甾醇、对羟基苯甲酸。此外，在研究过程中由于一些代谢产物含量较低或其组成较为复杂，不能对其进行有效地分离和结构鉴定，因此，在后续试验中还需进一步优化发酵条件，并尽可能采用精确的分离纯化技术，深入挖掘HPFJ3次生代谢产物中的活性物质，以促进该类真菌资源及其活性代谢产物的开发与应用。

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Isolation and Identification of Antifungal Compounds from the Mycelium of Magnolia officinalis Endophytic Fungus HPFJ3

JIANG Huanian

(College of Ecology,Lishui University,Lishui 323000,China)

The methanol extract of the mycelium ofMagnoliaofficinalisendophytic fungusNigrosporasp.HPFJ3 having antifungal activity was analyzed to promote exploitation ofMagnoliaofficinalisendophytic fungi resources.By means of bioactivity guided isolation by column chromatography and high performance chromatography,three pure compounds were obtained,which were identified as ergosterol,p-hydroxybenzoic acid,4-hydroxy-18 carbonic acid respectively with the methods of MS and NMR.Antifungal activities of the three pure compounds were traced,and the results showed that ergosterol and p-hydroxybenzoic acid exhibited antifungal activity,and ergosterol showed stronger activity againstGaeumannomycesgraminiswith inhibition rate of 66.70%.However,the compound 4-hydroxy-18 carbonic acid showed no inhibitory effect.

endophytic fungi;Nigrospora;Gaeumannomycesgraminis; chemical constituent; structural identification; antifungal activity

2016-08-01

浙江省自然科学基金项目(LY13C140005)

姜华年(1965-)，男，浙江遂昌人，副教授，硕士，主要从事植物栽培基础科学的教学与研究。 E-mail:jhn2585736@163.com

时间：2016-11-25 14∶24∶33

S476;O657

A

1004-3268(2016)12-0082-07

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.030.html