根际促生细菌的筛选及其对小麦幼苗的促生作用

常慧萍,邢文会,夏铁骑,杨 雪,付瑞敏,王 丁,张 红*

(1.河南教育学院 生命科学系,河南 郑州 450046; 2.濮阳职业技术学院,河南 濮阳 457000)



根际促生细菌的筛选及其对小麦幼苗的促生作用

常慧萍1,邢文会1,夏铁骑2,杨 雪1,付瑞敏1,王 丁1,张 红1*

(1.河南教育学院 生命科学系,河南 郑州 450046; 2.濮阳职业技术学院,河南 濮阳 457000)

为了获得小麦根际促生菌，从小麦根际土壤中分别筛选具有固氮、解磷、解钾能力的菌株,测定其生长性能及与病原菌(小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、水稻纹枯病菌)的拮抗作用，对其进行生理生化及分子鉴定，并评价其对小麦幼苗的促生作用，以期为小麦复合微生物肥料的研制提供优良的菌株资源。结果表明,通过透明圈法初筛到透明圈较大的固氮细菌8株、解钾细菌8株、解无机磷细菌4株、解有机磷细菌4株。根据菌株产IAA、溶磷能力较高且产NH3、HCN或者铁载体的能力,筛选出8株细菌,分别与3种病原菌进行拮抗试验,复筛到HN1202、HK1216、HP1218三株细菌可以同时拮抗3种病原菌,且彼此之间没有拮抗反应。对3株菌的菌落特征、菌体形态及生理生化特性进行研究,结合菌株的16S rDNA序列分析,初步确定HN1202和HP1218属于假单胞菌属(Pseudomonas),HK1216为芽孢杆菌属(Bacillus)。分别用HN1202、HP1218、HK1216菌液对小麦种子进行浸种处理,小麦幼苗根长分别较对照(无菌液处理)显著增加12.6%、20.4%、17.5%,株高分别较对照显著增加11.8%、13.2%、8.8%,萌发5条根和6条根的比例均较对照显著增加。综上，筛选的小麦根际促生细菌可作为复合微生物肥料的功能菌株。

根际促生细菌; 筛选; 鉴定; 小麦幼苗; 促生作用

农业是我国的基础产业,在国民经济中一直占据着重要位置。化肥是保障粮食增产的重要因素,我国以占世界8%的耕地消耗了世界30%以上的化肥,长期过量施用化肥带来了环境污染、土壤板结、地力衰退、生态恶化和农产品品质下降等问题[1]。微生物肥料又称生物肥料、菌肥、接种剂,是一类以微生物生命活动及其产物使农作物得到特定肥效的微生物活体制品[2],具有环境友好、节约资源、绿色安全等特点。生产实践证明,微生物肥料在提升耕地土壤肥力、维持耕地土壤结构、保持耕地土壤健康、降低耕地土壤污染、提高农产品品质方面发挥着巨大的潜力,在国家耕地质量提升的需求中具有广阔的应用前景[3]。

微生物肥料的核心是特定的有效菌种,所以筛选性能优良的菌株是微生物肥料研制的关键。植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)指生存于植物根际、根表,并能直接或间接地促进或调节植物生长的微生物[4]。根际微生物研究的最终目标是充分利用根际微生物资源,促进植物生长、保持植物健康、减少农用化学品的投入,从而促进农业可持续发展[5]。从多种植物根际土壤中均可分离到PGPR菌株,如Zhang等[6]从烟草根际土壤中分离到洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)及产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)等,郭芳芳等[7]和马菁华等[8]分别从柳杉、西瓜根际土壤中分离到多黏类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa),胡春锦等[9]从甘蔗根际土壤中分离到假单胞菌属(Pseudomonas)及芽孢杆菌属(Bacillus)细菌,陈波等[10]从樱桃根际土壤中分离到产碱杆菌属(Alcaligenes)及肠杆菌属(Enterobacter)细菌,韩华雯等[11]从小麦和苜蓿根际土壤中分离到根瘤菌属(Rhizobium)和固氮菌属(Azotobacter)细菌,郑文波等[12]从花生根际土壤中分离到巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium),袁辉林等[13]从红树林根际土壤中分离到克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌。目前已发现20多个属的细菌具有促生防病潜能,其中假单胞菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、伯克霍尔德氏菌属最多。已报道的具有促生作用的PGPR种类虽然较多,但应用范围广和适应能力强的菌种仍然较少[14],PGPR优良菌株的筛选以及复合菌剂的研发与应用是目前生物肥料研究领域的热点之一,因而如何获得高效的PGPR菌株依然是当前研制高效生物肥料的关键。本研究根据PGPR的促生长指标如产植物生长素(IAA)、HCN、铁载体能力以及解磷、拮抗病原菌能力等从小麦根际土壤中筛选PGPR菌株,并研究其对小麦幼苗的促生作用,为微生物资源的开发利用提供理论依据和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 土壤及小麦 土壤样品采自郑东新区小麦田,取 0～20 cm土层的根系(带土)样品,保存于无菌纸袋中带回实验室。供试小麦种子为新麦26。

1.1.2 培养基及试剂 所用培养基为LB培养基[15]、PDA培养基[15]、Ashby培养基[16]、解钾细菌培养基[16]、PKO无机磷培养基[17]、蒙金娜有机磷培养基[17]、MM培养基[18]、CAS检测培养基[19-21]、Hoagland半固体培养基[22]及NB培养基(蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、NaCl 5.0 g、琼脂20 g,pH值7.2),所用缓冲液为磷酸盐(PBS)缓冲液[23]。

1.2 方法

1.2.1 小麦根际土壤悬液的制备 抖落小麦根系上较大的土壤颗粒,剪切为约3 cm的根段,混合各根段。称取10 g置于含有 90 mL无菌水的三角瓶中,充分振荡,即为小麦根际土壤悬液,将土壤悬液10 倍梯度稀释,制成10-1～10-7土壤稀释液。

1.2.2 小麦PGPR的初筛 分别取10-3～10-7土壤稀释液0.1 mL,均匀涂布到Ashby培养基、解钾细菌培养基、PKO无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基上初筛具有固氮、解磷、解钾的菌株。经28 ℃培养5～7 d,挑取透明圈较大的单菌落,经多次传代培养,选取长势较好的菌株保存。

1.2.3 小麦PGPR的复筛 根据初筛菌株的促生长特性进行复筛。

1.2.3.1 产IAA能力 IAA标准曲线的绘制:称取IAA的标准品,用双蒸水分别配制10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L溶液,并测定各质量浓度溶液的OD530值,绘制IAA的标准曲线[24]。

将初筛菌株接种于MM液体培养基中,25 ℃、180 r/min振荡培养12 d,取培养液离心得上清液。取1 mL上清液加入 2 mL Salkowski’s 反应液(10.8 mol/L H2SO4溶液、4.5 g/L FeCl3),暗处25 ℃混合反应 30 min。测定混合反应液OD530值,以空白培养基作为对照。根据IAA的标准曲线,计算菌株产生IAA的量[24]。

1.2.3.2 产NH3能力 将初筛菌株接种到含10 mL10 g/L蛋白胨溶液的试管中,28 ℃培养2～3 d,每管加入0.5 mL Nessler’s试剂,观察液体颜色的变化,液体由褐色变为黄色表明菌株具有产生NH3的能力。

1.2.3.3 产HCN能力 将初筛菌株划线接种于含有4.4 g/L甘氨酸的NB培养基中,同时将浸过2%碳酸钠、0.5% 2,4,6-三硝基苯酚溶液的滤纸平铺于培养基上,密封,28 ℃培养4 d,观察滤纸颜色的变化,滤纸由橘黄色变为红色说明该菌株具有产生HCN的能力。

1.2.3.4 产铁载体能力 将初筛菌株接种于LB培养基中培养至对数期,用灭菌的牙签将菌种点接在CAS固体检测平板上,每皿3个接种点,28 ℃培养2 d。观察菌落周围是否出现明显的橙色铁载体晕圈,以判断是否具有产铁载体的能力[20-21]。

1.2.3.5 解磷能力 将初筛菌株接种于LB培养基中培养至对数期,按照1%的接种量接种到液体PKO培养基(或蒙金娜有机磷培养基)中,于28 ℃、160 r/min振荡培养5 d,并在4 ℃、10 000 r/min离心20 min,采用钼锑抗比色法测定有效磷含量[19,25]。

1.2.3.6 拮抗病原菌能力 采用平板对峙法测定初筛菌株与病原菌的拮抗作用。将小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)接种到PDA平板上,25 ℃培养5～7 d。初筛菌株接种于LB液体培养基中,150 r/min振荡培养48 h。再将病原菌与初筛菌株同时接种在PDA平板上,平板中心接种病原菌菌饼(直径为5～6 mm)，距中心约3 cm处,滴加初筛菌株悬液。25 ℃培养3～5 d,记录病原菌的菌落半径(R)、病原菌点样中心点到被初筛菌株抑制的边缘的半径(r)，计算抑制率,抑制率=(R-r)/R×100%[26]。

1.2.4 小麦PGPR菌株的形态特征及生理生化特性测定 对筛选的菌株间进行拮抗试验,对无拮抗反应的菌株进行组合,作为复合微生物肥料的功能菌株。并对筛选所得菌株的菌落特征、菌体形态、染色性及生理生化特性进行研究,依据《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定[27]。

1.2.5 小麦PGPR菌株的分子鉴定 提取HN1202、HK1216、HP1218三株菌的总DNA,采用PCR扩增细菌的16S rDNA基因序列。PCR扩增上游引物8f 序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物1541r 序列为5′-AAGGAGGTGATCCANCCRCA-3′。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,30个循环;最后72 ℃延伸10 min[18]。纯化获得的PCR产物送至微基生物科技有限公司进行测序。测序结果在NCBI网站上进行BLAST序列比对。使用MEGA 6.0软件,采用NJ法构建系统进化树。

1.2.6 小麦PGPR菌株对小麦幼苗的促生作用测定 将筛选的菌株接种到LB液体培养基中,28 ℃、160 r/min振荡培养至对数后期或稳定期,用PBS缓冲液洗涤菌体2～3次并稀释至菌液浓度约为1×108cfu/mL。选取饱满、均匀一致的小麦种子,用蒸馏水冲洗干净并浸泡4 h,然后移至75%乙醇中处理1 min,无菌水清洗后,再用5%的NaClO溶液浸泡5 min,无菌水清洗,进行种子表面消毒。将消毒的小麦种子置于培养皿中,25 ℃暗处萌发2 d。挑选萌发的健壮的小麦种子浸入菌液中,25 ℃吸附1 h,播种于Hoagland半固体培养基中,于人工智能培养箱中(14 h 光照/10 h 黑暗,相对湿度40%～50%)25 ℃培养10 d。将萌发的小麦种子浸泡在PBS缓冲液中作为空白对照,培养条件同接种菌液处理。第10天测量幼苗的根长与株高,并统计萌发的根数。

2 结果与分析

2.1 小麦PGPR菌株的初筛结果

在Ashby培养基、解钾细菌培养基、PKO无机磷培养基、蒙金娜有机磷培养基平板上分别涂布小麦根际土壤稀释液,28 ℃培养,挑取有透明圈的固氮细菌20株、解钾细菌20株、解无机磷细菌12株、解有机磷细菌12株,各菌株再经多次传代,最终选取长势较好、透明圈较大的固氮细菌8株(HN1201—1208)、解钾细菌8株(HK1209—1216)、解无机磷细菌4株(HP1217—1220)、解有机磷细菌4株(HP1221—1224)。

2.2 小麦PGPR菌株的复筛结果

对长势较好的8株固氮细菌、8株解钾细菌、4株解无机磷细菌、4株解有机磷细菌进行生长性能的测定,结果见表1。根据菌株可产IAA、解磷能力较高,且具有产NH3、HCN或者铁载体的能力,筛选出HN1202、HN1206、HK1215、HK1216、HP1218、HP1220、HP1223、HP1224菌株(表1),与病原菌进行拮抗作用试验。

表1 小麦PGPR菌株的促生长性能测定结果

注：-表示阴性，+表示阳性，下同。

将筛选出的8株菌分别与小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、水稻纹枯病菌进行拮抗作用试验,结果见表2。根据表2可知,对3种病原菌均有抑制能力的菌株为HN1202、HK1216、HP1218、HP1223。

2.3 小麦PGPR菌株的菌落形态特征及部分生理生化特性

对复筛获得的HN1202、HK1216、HP1218、HP1223进行菌株间的拮抗反应测定,发现HN1202、HK1216、HP1218彼此之间不发生拮抗反应。对3个菌株的菌落特征、形态特征及生理生化特性进行研究(表3)发现,HN1202和HK1216菌落为乳白色、边缘有缺刻,HP1218菌落淡黄色、边缘整齐;3株菌均为杆状，均具有鞭毛。HN1202和HP1218为革兰氏阴性菌,不产芽孢,能发酵葡萄糖、利用甘露醇,吲哚、甲基红试验阴性，接触酶、氧化酶、过氧化氢酶试验均为阳性。另外，HN1202能液化明胶、还原硝酸盐,V-P反应阳性；HP1218能水解淀粉、利用柠檬酸盐，V-P反应阴性。HK1216为革兰氏阳性菌,产芽孢,能发酵葡萄糖、水解淀粉、液化明胶,吲哚试验阴性、V-P反应阴性、甲基红试验阳性，接触酶、过氧化氢酶试验阳性，可还原硝酸盐、利用甘露醇。

表2 小麦PGPR菌株对病原菌的抑菌率 %

表3 小麦PGPR菌株的菌落形态特征及部分生理生化特性

2.4 小麦PGPR菌株的初步鉴定

对HN1202、HK1216、HP1218菌株的16S rDNA基因序列进行比对分析发现,HP1218与假单胞菌S2(Pseudomonassp.)的同源性高达99%,HN1202与假单胞菌K1(Pseudomonassp.)同源性高达99%，HK1216与芽孢杆菌Y8(Bacillussp.)的同源性高达99%。结合HN1202、HK1216、HP1218菌落形态、生理生化特性及基于16S rDNA序列的系统进化树(图1)初步确定,HN1202和HP1218属于假单胞菌属(Pseudomonas),HK1216为芽孢杆菌属(Bacillus)。

图1 采用NJ法构建的系统进化树

2.5 小麦PGPR菌液浸种对小麦幼苗的促生长作用

HN1202、HP1218、HK1216浸种处理小麦幼苗根长分别为11.6、12.4、12.1 cm,分别较对照显著增加12.6%、20.4%、17.5%,株高分别为15.2、15.4、14.8 cm,分别较对照显著增加11.8%、13.2%、8.8%(图2)。HN1202、HP1218、HK1216浸种处理萌发5条根的小麦种子所占比例分别为33.4%、35.5%、33.7%,均显著高于对照(31.6%);萌发6条根的小麦种子所占比例分别为11.3%、13.5%、11.6%,均显著高于对照(9.4%)(图3),表明菌株HN1202、HP1218、HK1216对小麦种子幼苗生长和生根均有明显的促进作用。

*表示与CK差异显著(P<0.05),下同

图3 小麦PGPR浸种对小麦幼苗萌发根数的影响

3 结论与讨论

本研究通过透明圈法初筛到透明圈较大的固氮细菌8株、解钾细菌8株、解无机磷细菌4株、解有机磷细菌4株。根据菌株产IAA、溶磷能力较高且产NH3、HCN或者铁载体的能力,筛选出8株细菌,分别与3种病原菌进行拮抗试验,复筛到HN1202、HK1216、HP1218三株细菌可以同时拮抗3种病原菌(小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、水稻纹枯病菌)且彼此之间没有拮抗反应。对3株菌的菌落特征、菌体形态及生理生化特性进行研究,结合菌株的16S rDNA序列分析,初步确定HN1202和HP1218属于假单胞菌属(Pseudomonas),HK1216为芽孢杆菌属(Bacillus)。分别用HN1202、HP1218、HK1216菌液对小麦种子进行浸种处理,小麦幼苗根长分别较对照(无菌液处理)显著增加12.6%、20.4%、17.5%,株高分别较对照显著增加11.8%、13.2%、8.8%,萌发5条根和6条根的比例均较对照显著增加。本研究筛选的3株细菌具有多种促生机制,具有较大的应用潜力,但需要进行菌株组合，然后通过大田试验进一步研究。

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Screening of Plant Growth-promoting Rhizobacteria and Their Growth-promoting Effect on Wheat Seedling

CHANG Huiping1,XING Wenhui1,XIA Tieqi2,YANG Xue1,FU Ruimin1,WANG Ding1,ZHANG Hong1*

(1.Department of Life Sciences,Henan Institute of Education,Zhengzhou 450046,China;2.Puyang Vocational and Technical College,Puyang 457000,China)

In order to obtain plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR),some strains with nitrogen-fixing,potassium-dissoloving and phosphorus-dissoloving abilities were isolated from rhizosphere soil of wheat,after identifying these strains through phenotypic,physiological,biochemical and phylogenetic characterization,both their growth performance and antagonistic capability against three kinds of plant pathogens which respectively caused fusarium head blight (FHB),wheat sharp eyespot(WSE) and rice sheath blight (RSB) were tested,and their growth-promoting effects on wheat seedling were evaluated,so as to provide excellent strains for the production of functional microbial fertilizers.The results showed that the preliminary screening was carried out by using the transparent zone method and eight strains of nitrogen-fixing bacteria,eight strains of potassium-dissoloving bacteria,four strains of inorganic phosphorus-dissoloving bacteria and four strains of organophosphorus-dissoloving bacteria were picked out.The further screening was carried out by testing their ability of solubilizing phosphorus and producing IAA,NH3,HCN and siderophore,and eight strains were picked out.After testing their antagonistic capability against three kinds of plant pathogens,three rhizosphere strains (HN1202,HK1216,HP1218) with significant antagonistic ability against pathogens and without antagonism between each other were screened,and respectively identified through phenotypic,physiological,biochemical and phylogenetic(16S rDNA) characterization.After primary identification,both strain HN1202 and HP1218 belonged toPseudomonassp.,HK1216 belonged toBacillussp.Compared to control without strains,after inoculating wheat seeds with the strains (HN1202,HP1218 and HK1216) respectively,the average root length of wheat seedlings were increased by 12.6%,20.4% and 17.5% respectively;moreover,the average height of wheat seedlings were increased by 11.8%,13.2% and 8.8% separately,and the proportion of five or six roots-germination had been increased significantly.To sum up,the PGPR in this study could be used for the production of functional microbial fertilizers.

plant growth-promoting rhizobacteria; screening; identification; wheat seedling; growth promotion

2016-07-25

河南省基础与前沿技术研究项目(152300410092)；河南省高等学校重点科研项目(15B180002，15B180016，15A210020)

常慧萍(1970-)，女，河南原阳人，副教授，博士，主要从事微生物资源开发与应用研究。 E-mail:shengwuchp@126.com

*通讯作者：张 红(1967-)，女，河南信阳人，教授，博士，主要从事分子生物学与免疫学研究。 E-mail:angela9922@sina.com

时间：2016-11-25 14:24:33

S512.1;S182

A

1004-3268(2016)12-0052-06

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.015.html