抗肝癌合剂对荷肝癌H22小鼠肿瘤细胞周期的影响

钱 玥周维顺

抗肝癌合剂对荷肝癌H22小鼠肿瘤细胞周期的影响

钱 玥1周维顺2

目的观察抗肝癌合剂对荷肝癌H22小鼠移植瘤的生长及肿瘤细胞周期分布的影响。方法60只昆明小鼠随机分为模型组、抗肝癌合剂高、中、低剂量组、氟尿嘧啶组（5-FU组）和抗癌合剂中剂量+氟尿嘧啶组（中剂量+5-FU组），将H22腹水型瘤细胞悬液接种至昆明小鼠右腋窝皮下制备局灶性肿瘤模型，分组灌胃给药。10天后，小鼠剥离移植瘤，称取瘤重，计算抑瘤率，流式细胞仪检测分析细胞周期情况，计算细胞增殖指数。结果抑瘤率：抗肝癌合剂低、中、高剂量组及5-Fu组、中剂量+5-Fu组分别为0.64%、15.17%、15.08%、64.86%、66.33%；平均瘤重：低剂量组与模型组无明显差异[（1.3133±0.2840）g比（1.3217±0.2929）g，P＞0.05]；中、高剂量组比模型对照组降低[（1.1212±0.1928）g、（1.1224±0.1772）g比（1.3217±0.2929）g，P＜0.05]，但两组间无差异[（1.1212± 0.1928）g比（1.1224±0.1772）g，P＞0.05]；5-Fu组、中剂量+5-Fu组比模型对照组降低[（0.4645± 0.0923）g、（0.4450±0.1085）g比（1.3217±0.2929）g，P＜0.01]；各用药组均能使肿瘤组织细胞阻滞于G0/G1期，表现为G0/G1期细胞增多，S、G2/M期细胞相应减少，细胞增殖指数PI各用药组均小于模型对照组，低剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义[（64.18±8.35）%比（69.10±4.39）%，P＞0.05]；其余各组与模型对照组比较[（56.60±7.87）%、（54.30±7.08）%、（47.61±9.66）%、（40.83±9.92）%比（69.10±4.39）%]差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论抗肝癌合剂对荷肝癌H22小鼠肿瘤的生长有明显的抑制作用，使肿瘤组织细胞阻滞于G0/G1期。

小鼠；肝癌；细胞周期；抗肝癌合剂

原发性肝癌（Primary hepatic carcinoma，PHC）是最常见的恶性肿瘤之一，近年发病率和死亡率均有所增加[1-2]。目前治疗肝癌的方法包括手术切除、肝移植等[3]。研究表明，中医药在稳定瘤灶、增加机体免疫功能、改善患者临床症状、减轻放化疗毒副作用、延长带瘤生存时间等方面均具有优势[4]。周维顺教授从事中西医结合肿瘤内科工作40余年，根据中医对肝癌病因病机的认识和自身长期的临床经验，以清热解毒、疏肝理气为主要原则组方，制备成抗肝癌合剂，经过临床实践证实，抗肝癌合剂对稳定瘤体生长、改善患者症状体征、提高其生存质量、延长生存期以及放化疗后的减毒增效均有较肯定的疗效。本研究旨在探讨该方抗肿瘤的作用机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康昆明（KM）种小鼠60只，8周龄，雄性，体质量（20.0±2.0）g，清洁级（由浙江中医药大学医学实验动物中心代购，动物合格证号：SCXK（沪）2014-0002）。小鼠群养，每笼5只，实验期间自由饮食，标准饲料由浙江中医药大学医学实验动物中心提供。实验室室温18～22℃，相对湿度40%～60%。

1.2 瘤源动物 已接种H22腹水型肝癌细胞7天，腹水生长良好的昆明小鼠3只（购自中国科学院上海细胞生物研究所）。

1.3 实验药品 抗肝癌合剂（白花蛇舌草、半枝莲、猫人参、猫爪草各30g，猪苓、茯苓各15g，灵芝、焦山楂、蒲公英各30g，柴胡、赤芍、白芍、莪术各10g,广郁金12g，原始处方单贴总剂量为292g，由浙江中医药大学风湿免疫实验室制备成高剂量组浓度，为每毫升含生药2.42g，4℃冰箱保存备用）；注射用氟尿嘧啶（5-Fu，购自浙江省中医院，南通精华制药有限公司，批准文号：国药准字H32022246，规格：10mL：0.25g）。

2 实验方法

2.1 造 模 无菌条件下操作，取接种10天的H22肝癌腹水型小鼠腹水，加生理盐水稀释成瘤细胞悬液浓度为1×107个瘤细胞/mL。昆明小鼠皮下接种瘤细胞悬液0.2mL，制备局灶性肿瘤模型。

2.2 分 组 60只KM小鼠分别称重，参照随机对照数字表随机分成模型组、抗肝癌合剂高剂量组（高剂量组）、抗肝癌合剂中剂量组（中剂量组）、抗肝癌合剂低剂量组（低剂量组）、氟尿嘧啶组（5-Fu组）及抗肝癌合剂中剂量+氟尿嘧啶组（中剂量+5-Fu组），每组10只，分笼饲养，每笼以不同部位方式标记（头、背、尾、左前、左后、右前、右后、空白）。

2.3 给 药 以成人用量折算成小鼠低剂量组[5]的用药量得出5-Fu为0.5mg/20g，中药为1.168g/20g，先确定中药中剂量组给药量，高、中、低剂量差为2的等比级数。实验动物瘤株接种后24h（即次日10am）开始分组给药，灌胃容积均为0.4mL/20g，每天给药2次，连续灌胃10天，共计给药10次。中剂量+ 5-Fu组的中药给药量及方式同中药中剂量组，5-Fu给药量及方式同5-Fu组。

2.4 观察指标 （1）对肿瘤生长的影响：实验第11天（即末次给药后24h）小鼠脱颈椎处死，剥离腋窝皮下肿瘤，称量瘤重，计算抑瘤率。抑瘤率%=模型组平均瘤重-实验组平均瘤重/模型平均瘤重×100%；（2）对肿瘤组织细胞周期的影响：采用流式细胞技术，计算G0/G1、S、G2/M在细胞周期中所占的百分比及细胞增值指数PI（proliferous index）值，PI%=[（S+G2/M）÷（G0/G1+S+G2/M）]×100%，最后通过Modfit软件分析数据。

2.5 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行数据分析；计量资料数据用均数±标准差（±s） 表示，多组间均数比较采用方差分析，两组间均数比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 肿瘤生长情况 全部小鼠接种后，均有皮下结节生长，各用药组小鼠的皮下结节均较模型组为小。实验过程中，5-FU组死亡1只。低剂量组抑瘤效果不明显，抑瘤率只有0.64%，平均瘤重与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；中、高剂量组抑瘤率分别为15.17%、15.08%，平均瘤重与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），但两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；5-Fu组与中剂量+5-Fu组抑瘤率相近，分别为64.86%、66.33%，平均瘤重亦相近，但与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；与5-Fu组比较，中剂量+5-Fu组平均瘤重更小，抑瘤率更高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠平均瘤重和抑瘤率比较

3.2 接种部位瘤结节（组织）细胞周期分布 各用药组小鼠接种部位瘤结节（组织）细胞周期分布较模型组均呈现明显细胞G0/G1期阻滞，表现为G0/G1期细胞增多（P＜0.01），S、G2/M期细胞相应减少（P＜0.05 或P＜0.01）。S期：5-Fu组、中剂量+5-Fu组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；G2/M期：低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），中、高剂量组显著低于模型组（P＜0.05），5-Fu组、中剂量+5-Fu组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。细胞增殖指数PI：各组均较模型组为小，低剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；其余各组与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表2，图1～6（封二）。

4 讨论

中医认为，肝失疏泄容易引起气机郁滞，甚至气机上逆，气有余便是火。肝脏特性为阳常有余，阴常不足，阳盛则热。因此，热毒是肝癌癌毒发生、发展的重要病理因素；导致热毒产生的因素众多，热毒生成之后又可与其他病理因素互相影响，既是肝癌的致病因素，又是其病理产物[6]。周维顺教授根据肝癌外感火热侵袭，热毒凝结为主的病机，以及肝本身“体阴用阳”的属性，治疗以清热解毒大法为主，佐以疏肝理气，益气养阴，确立抗肝癌合剂复方，方中白花蛇舌草、半枝莲、猫人参、猫爪草、猪苓、茯苓、蒲公英等均为清热解毒利湿抗癌之品，为主药；柴胡疏解肝郁、与芍药养血敛阴柔肝，一升一敛相配；热毒郁滞，肝气郁结，血行不畅，加以广郁金、莪术共奏疏肝解郁，行气活血之效；热毒能损伤气阴，灵芝能益气养阴，扶正抗癌；过用苦寒之品易败胃伤脾，焦山楂可健脾和胃。诸药合用，有清热解毒抗癌、疏肝行气解郁、扶正养阴祛邪之功。全方配伍精良，以清热解毒利湿治其湿热，疏肝行气解郁散其郁结，辅以益气养阴扶其正气，健脾和胃顾护胃气，祛邪而不伤正，标本兼顾。

恶性肿瘤区别于良性肿瘤的一个重要特征是其失控性的增殖[7]。由于肿瘤细胞周期“start”位点的失控，大量G0期细胞无限制地通过G1/S和G2/M转换，最终导致细胞的异常增殖，细胞核DNA含量异常，DNA倍体异常或在细胞周期中S期细胞增多,而肿瘤细胞一旦进入S期即开始DNA合成，无特殊干扰，便能按细胞周期的顺序不断增殖发展。

本实验结果显示，各用药组实验小鼠的接种部位瘤结节（组织）的瘤重均小于对照组，抑瘤率明显提高，而各用药组的细胞周期分布较模型组均呈现明显的细胞G0/G1期阻滞，表现为G0/G1期细胞增多，S、G2/M期细胞相应减少；抗癌合剂单药组的效果呈一定的剂量相关性，而中剂量+5-FU组的作用明显优于抗癌合剂单药组及5-FU组。因此，我们推断，抗肝癌合剂有明确的抗癌作用，且与剂量相关；抗肝癌合剂可能增强5-FU的抗肿瘤效应，其抗癌机制之一可能是抗肝癌合剂促使肿瘤细胞阻滞于G0/ G1期，但其他作用机制还有待于进一步研究。

表2 各组小鼠肿瘤组织细胞周期比较（%，±s）

表2 各组小鼠肿瘤组织细胞周期比较（%，±s）

注：与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别模型组低剂量组中剂量组高剂量组5-Fu组中剂量+5-Fu组鼠数10 10 10 10 9 10细胞周期分布G0/G1 30.90±4.39 35.82±8.35 43.40±7.87△△45.71±7.08△△56.43±5.29△△59.17±9.92△△S 41.98±9.98 41.01±7.50 37.15±8.01 35.98±7.08 31.61±7.46△△29.07±5.87△△G2/M 27.12±9.71 23.17±7.42 19.45±6.60△18.32±8.85△12.53±8.86△△11.76±8.91△△PI 69.10±4.39 64.18±8.35 56.60±7.87△△54.30±7.08△△47.61±9.66△△40.83±9.92△△

［1］Quivrin M，Momex F，Enachescu C，et al.Primary liver cancer［J］.Cancer Radiother，2010，14（Suppl 1）：103-110.

［2］孙燕，石远凯.临床肿瘤内科手册［M］.第5版.北京：人民卫生出版社，2012：470.

［3］Liu L，Zhu XD，Wang WQ，et al.Activation of beta-catenin by hypoxia in hepatocellular carcinoma contributes to en-hanced metastatic potentialand poor prognosis［J］.Clin CancerRes，2010，16（10）：2740-2750.

［4］王锦鸿.中医在治疗恶性肿瘤中的地位和作用［J］.江苏中医，2012，22（11）：1-3.

［5］陈奇.中药药理研究方法学［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2011：1235.

［6］姜家康，陈瑞睿，刘洪星，等.关于“肝之癌毒”理论的简述［J］.中医药信息，2012，29（4）：12-13.

［7］汤钊猷.现代肿瘤学［M］.第3版，上海：复旦大学出版社，2011：139.

（收稿：2016-01-18 修回：2016-03-11）

Effect of Melting Agent of Anti-Liver Cancer on the Mitotic Cycle of Tumor Cells in H22 Tumor-bearing Mice

QIAN Yue1,ZHOU Weishun2. 1First and Second Ward,Wuyun Mountain Sanatorium of Hangzhou(310008), China;2Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo observe the effect of melting agent of anti-liver cancer（MAALC）on the tumor growth and the mitotic cycle of H22 tumor-bearing mouse model.MethodsSixty KM mice were randomly divided into model group,low-dose,mid-dose,and high-dose MAALC groups,5-FU group,and mid-dose MAALC+5-FU group. All mice were inoculated with the H22 liver cancer cell at right armpit,then treated with the corresponding medicine for 10 d.And then all mice were killed to detach the tumor.The detached tumors were weighted and the inhibitory rate were calculated.The mitotic cycle of tumor cells was analyzed by flowcytometry and the proliferation index were calculated.ResultsThe inhibitory rates low-dose,mid-dose,and high-dose MAALC groups,5-FU group and MAALC+5-FU group were 0.64%,15.17%,15.08%,64.86%,66.33%.Compared with that in model group（1.3217±0.2929g）,the average tumor in low-dose MAALC group was not different（1.3133±0.2840,P＞0.05）, but that in mid-dose and high-dose MAALC groups were lighter（1.1212±0.1928,1.1224±0.1772,P＜0.05）;no significant difference was found between the two groups（P＞0.05）;that in 5-FU group and MAALC+5-FU group were significant lighter（0.4645±0.0923,0.4450±0.1085,P＜0.01）.MAALC hindered the tumor cell in the G0/G1 phase, that is,the G0/G1 cells increased,while the S and G2/M cells correspondingly decreased.Compared with that in model group（69.10%±4.39%）,the proliferation index in mid-dose MAALC,high-dose MAALC,5-FU,and MAALC+5-FU groups（56.60%±7.87%,54.30%±7.08%,47.61%±9.66%,40.83%±9.92%;P＜0.05 or P＜0.01）were significantly lower except for that in low-dose MAALC group（64.18%±8.35%,P＞0.05）.ConclusionMAALC canobviously restrain the growth of tumor and hinder the tumor cell in the G0/G1 phase.

mice;liver cancer;mitotic cycle;MAALC

·经验交流·

浙江省教育厅资助项目（No.B0613）

1杭州五云山疗养院一二疗区（杭州 310008）；2浙江省中医院肿瘤科（杭州 310006）

钱玥，Tel：13516811226；E-mai：66182119@qq.com