胃癌组织miR-155的表达及其与临床预后的关系

周 明， 马建明

扬州市第一人民医院普通外科， 扬州 225001

论 著

胃癌组织miR-155的表达及其与临床预后的关系

周 明， 马建明*

扬州市第一人民医院普通外科， 扬州 225001

目的：探讨胃癌组织miR-155的表达水平及其临床意义。方法：收集手术切除的胃癌标本116例，采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测癌及癌旁组织miR-155的表达水平，分析其与临床病理的关系及对临床预后的影响。采用免疫组织化学法检测癌组织中PTEN的表达，分析其表达与miR-155的相关性。结果：胃癌组织miR-155表达高于配对癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.001)；miR-155高表达与肿瘤TNM分期、侵犯层次、淋巴结转移有关(P<0.05)。K-M曲线分析表明，miR-155高表达预示着较低的3年无病进展率(P<0.001)及总生存率(P<0.001)。PTEN表达与miR-155负相关，miR-155高表达患者PTEN表达低(P<0.001)。结论：miR-155与胃癌发生发展密切相关，可能是胃癌潜在的临床诊断及预后指标。

胃癌；miR-155；PTEN；临床意义；预后

胃癌在我国发病率、死亡率较高，严重威胁国人的生命健康，但目前发病机制仍未完全明确[1-3]。微小RNA(miRNAs)在调控肿瘤发生、侵袭及转移等多个环节发挥重要作用，可能是肿瘤临床诊治新的靶点，成为目前肿瘤精准医学研究的热点。既往研究[4-7]表明：miR-155在包括结直肠癌、乳腺癌在内的多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤的发生发展密切相关。因此，本研究采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测胃癌组织miR-155的表达，并分析其与胃癌患者临床预后间的关系，探讨其在胃癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2010年7月至2013年4月扬州市第一人民医院普通外科手术切除的胃癌标本116例。每例标本均配对距肿瘤5 cm以上的癌旁组织。手术标本离体后，5 min内无菌取材并迅速存放在液氮，于-80℃冰箱中保存。患者包括男性46例，女性70例；年龄 37～83岁，平均(59±3)岁。入选标准：经病理确诊的原发性胃癌患者，术前未行放化疗；患者及家属配合，并签署知情同意书，愿意提供临床随访资料。排除标准：术前行新辅助化疗；病理确定为转移性胃癌。本研究通过医院医学伦理委员会审核。

1.2 组织总RNA的提取及反转录反应 胃癌组织及癌旁组织总RNA的提取采用RNA提取试剂盒(美国LC Science公司)，按照试剂盒说明书操作。琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的完整性。miR-155茎环反转录反应引物为5′-CGC TGC TAC CTG AGA GTA GAC CAG ATG CAG CGA CCC CT-3′，由上海博仕生物服务公司设计合成。应用反转录试剂盒(上海博仕生物服务公司)配制10 μL反转录体系，反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s，反应结束后放-20℃保存。

1.3 Real-time PCR检测miR-155的表达 引物由上海博仕生物服务公司设计合成，miR-155上游引物：5′-TTA ATG CTA ATC GTG ATA G-3′，下游引物：5′-ACC TGA GAG TAG ACC AGA-3′；内参U6上游引物：5′-CTT CGG CAG CAC ATA TAC TAA AAT-3′，下游引物：5′-CAG GGG CCA TGC TAA ATC TTC-3′。应用SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)配制25 μL PCR反应体系，反应条件为：94℃ 3 min预变性后，94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 30 s；35个循环。所有反应设2个复孔。记录每个反应管中的荧光信号达到所设立阈值时所经历的循环数(即Ct值)，将原始数据取2次重复的平均值后，用内参基因进行归一化，分别计算癌组织及配对癌旁组织中的miR-155的相对表达量。

1.4 免疫组化法检测PTEN的表达 将所有患者胃癌病理标本制作4 μm厚度病理切片，严格按照GeneTech的EnVision免疫组化试剂盒说明书进行S-P法免疫组化染色。每张免疫组化切片在光镜下随机取3个视野拍照保存后，根据染色强度和阳性细胞百分率对免疫组化结果进行半定量分析。由2位病理科医师独立进行免疫组化染色评分后取均值。染色强度评分如下：未着色者计0分，着色浅者计1分，中度着色者计2分，强着色者计3分。阳性细胞百分率评分如下：阴性者计0分，阳性细胞数≤10%者计1分，11%～50%者计2分，51%～80%者计3分，≥80%者计4分。每张切片计分=染色强度×阳性细胞百分率。

1.5 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件分析。用Kolmogorov-Smirnov检验分析每组数据是否符合正态分布。数据均以中位数(四分位数)表示。采用非参数Wilcoxon符号秩和检验分析胃癌组织和配对癌旁组织miR-155表达差异。用Mann-WhitneyU检验和Kruskal-Wallis检验分析miR-155表达水平与胃癌临床各病理参数之间的关系。生存曲线用Kaplan-Meier(K-M曲线)方法创建，并用Log-rank方法检验。PTEN的表达和miR-155表达的相关性采用Pearson相关分析。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 胃癌及癌旁组织中miR-155的表达差异 结果(图1)表明：癌组织miR-155的表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.001)。

图1 胃癌与癌旁正常组织中miR-155的表达差异

2.2 胃癌组织miR-155表达水平与患者临床病理特征的关系 结果(表1)表明：胃癌组织miR-155表达水平与侵犯层次、TNM分期、淋巴结转移明显相关(P<0.05)，高表达miR-155患者较低表达患者有较深的肿瘤浸润深度、较高的TNM分期及较多的淋巴结转移，而与性别、年龄、肿瘤大小及脉管侵犯无明显相关。

2.3 胃癌组织miR-155表达与胃癌患者临床生存之间的关系 本研究限定36个月为随访总生存期及无病进展期的截点。结果表明：随访期内，116例患者中有68例进展，61例死亡。3年总累计无病生存率及总生存率分别为41.4 % 和47.4%。为研究miR-155表达对预后的影响，依据miR-155在胃癌患者中表达的中位数分为高表达组及低表达组。采用K-M曲线分析miR-155表达在胃癌患者预后中的意义。3年累计无病生存率在高表达组为17.9 %，明显低于低表达组的42.5 %(P<0.001，图2A)；3年累计总生存率在高表达组为22.0%，明显低于低表达组的50.5 %(P<0.001，图2B)。

表1 胃癌组织miR-155表达与患者临床病理特征的关系

图2 胃癌患者基于miR-155表达的Kaplan-Meier生存曲线A：3年无病进展生存率；B：3年总生存率

2.4 miR-155表达与抑癌基因PTEN表达的相关性 结果表明：miR-155表达与PTEN表达负相关(r=-0.8453,P<0.001)，miR-155高表达患者PTEN表达较低(图3、图4)。

图3 胃癌组织miR-155不同表达组中PTEN蛋白的表达Original magnification: ×20 (A, B), ×40 (C, D)

图4 胃癌组织PTEN的表达与miR-155表达的相关性

3 讨 论

Tsukamoto等[6]采用基因芯片方法分析470种miRNA在胃癌中表达，筛选出胃癌miRNAs表达谱。Zhang等[7]研究结果显示，miR-21在胃癌组织中表达上调，其通过作用于靶基因第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸脂酶基因(PTEN)，从而促进胃癌增殖和转移。这些研究结果表明，miRNAs发挥促癌基因或抑癌基因作用，参与胃癌发生发展。

MiR-155是一种经典的多功能miRNA，参与许多生物过程，包括造血、免疫及炎症反应。miR-155可以抑制Caspase-3或促凋亡基因TP53BP1的活性，起到抗凋亡的作用[8]，还可以通过下调SOCS1基因起到促进增殖的作用[9]。Yamanaka等[10]发现，miR-155在淋巴瘤/白血病中高表达，通过下调抑癌基因，如PTEN、PDCD4 和SHIP1，激活Akt信号通路促进疾病进展。Du等[11]发现，miR-155在鼻咽癌中高表达，且能够下调与疾病进展及临床预后相关的基因JMJD1A的表达。以上证据显示，miR-155在恶性肿瘤的发生、进展及预后方面起着不可忽视的作用。

为了探讨miR-155在胃癌中的作用，本研究采用RT-qPCR技术检测116例胃癌及配对癌旁组织miR-155的表达水平，并分析其与胃癌临床病理特征的关系。本研究结果显示，miR-155在胃癌组织中表达升高，且高表达miR-155与TNM分期、肿瘤侵犯层次及淋巴结转移有关。研究结果发现，miR-155的表达与PTEN负相关，miR-155高表达患者PTEN表达较低，提示miR-155在胃癌中可能通过靶向PTEN蛋白发挥致癌作用，且参与胃癌进展。

为了进一步研究miR-155的表达在胃癌患者预后中的作用，本研究随访了术后116例胃癌患者。36个月的随访期内，116例患者中有68例进展，61例死亡。K-M曲线分析结果提示：3年累计无病生存率在miR-155高表达组为17.9%，而在低表达组为42.5%。3年累计总生存率在高表达组为22.0%，低表达组为50.5%。Log-rank检验提示：miR-155高表达组的3年累计无病生存率及3年累计总生存率均低于miR-155低表达组(P<0.001)。结果提示高miR-155表达可能预示着胃癌患者较差的预后。

Lu等[12]报道，miR-155在胃癌组织中高表达，并且参与胃癌的进展，与本研究结果一致。本研究纳入了含有116例患者的队列研究，并且对患者的预后进行了分析，发现miR-155在胃癌组织中也呈高表达趋势，并且还与TNM分期、肿瘤侵犯层次及患者的预后密切相关。

综上所述，miR-155可能是胃癌潜在的诊断、预后及治疗靶点，测定血浆中miR-155的表达可能会成为早期诊断胃癌及评价预后的辅助指标。

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[本文编辑] 叶 婷， 贾泽军

Expression of miR-155 in gastric cancer and its prognostic significance

ZHOU Ming, MA Jian-ming*

Department of General Surgery, Yangzhou No.1 People’ Hospital, Yangzhou 225001, Jiangsu, China

Objective：To discuss the expression of miR-155 and its clinical significance in gastric carcinoma.Methods：One hundred and sixteen pairs of human gastric carcinoma tissues were obtained from patients who underwent surgical resection.The level of miR-155 in 116 gastric cancer tissues and the adjacent normal gastric tissues were detected by real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-qPCR), and the association between miR-155 expressions with clinicopathological factors and prognostic values were explored.Immunohistochemical staining for PTEN in all pathological specimens from gastric cancer biopsy was performed.The correlationship between PTEN and miR-155 expression was analyzed.Results：The expression of miR-155 in gastric cancer tissues was higher than that of adjacent normal gastric tissues (P<0.001).The up-regulated expression of miR-155 was associated with TNM stage, invasion level and lymph node metastases (P<0.05).Kaplan-Meier analysis demonstrated that high miR-155 expression clearly predicted poorer progression free survival (PFS,P<0.001) and overall survival (OS) (P<0.001) within three years.PTEN expression was negatively correlated to miR-155 expression.Gastric cancer tissues with higher miR-155 expression disclosed lower PTEN expression (P<0.001).Conclusions：MiR-155 may plays a pivotal role in the development and progression of gastric carcinoma, and it may be the potential biomarker in the diagnosis and prognosis of gastric carcinoma.

gastric carcinoma; miR-155; PTEN; clinical significance; prognosis

2016-01-21[接受日期]2016-09-26

周 明，硕士生，主治医师.E-mail: 13852200328@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0514-82981199-81006, E-mail: genesis.7@live.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160076

R 735.2

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