辣椒中辣椒素类物质的液相色谱-串联质谱测定方法研究

邹 燕，冯德建，史谢飞，李怀平，谭和平

（中国测试技术研究院 茶叶标准与检测技术四川省重点实验室，四川 成都 610021）

辣椒中辣椒素类物质的液相色谱-串联质谱测定方法研究

邹 燕，冯德建，史谢飞，李怀平，谭和平

（中国测试技术研究院 茶叶标准与检测技术四川省重点实验室，四川 成都 610021）

建立液相色谱-串联质谱联用仪测定辣椒中辣椒素、二氢辣椒素和降二氢辣椒素3种辣椒素类物质的方法。样品用无水乙醇超声提取，经SB-C18色谱柱分离，以0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱，多重反应监测（MRM），外标法定量。结果表明：降二氢辣椒素和辣椒素质量浓度在1.0~10000.0ng/mL范围内与峰面积呈现良好线性关系，二氢辣椒素质量浓度在0.5~10000.0ng/mL范围内与峰面积呈现良好线性关系。方法的加标回收率为96.8%～104.0%，相对标准偏差均小于5%，检出限为0.075～0.15mg/kg，定量限为0.25～0.5mg/kg，具有操作简单、灵敏度高、准确性好、线性范围宽、所用试剂毒性小等优势，可很好地满足辣椒中辣椒素、二氢辣椒素和降二氢辣椒素3种辣椒素类物质的测定。

辣椒；辣椒素；二氢辣椒素；降二氢辣椒素；液相色谱-串联质谱联用

0 引 言

辣椒是茄科植物辣椒（Capsicum annuum L.）或其栽培变种的干燥成熟果实，其味辛、性热、归心、脾经，具有温中散寒，开胃消食之功效，用于寒滞腹痛，呕吐，泻痢，冻疮[1]，亦是日常生活中重要的蔬菜和调味品。辣椒素类物质是辣椒的主要活性成分，也是辣椒中辣味的来源，具有镇痛、抗癌、调节心血管压力、保护胃黏膜、减肥、刺激毛发生长等功能[2-3]，现已广泛应用于食品生产、医药制药、生物农药等领域。此类物质主要包括辣椒素（Capsaicin）、二氢辣椒素（Dihydrocapsaicin）和降二氢辣椒素（Nordihydrocapsaicin）、高二氢辣椒素（Homodihydrocapsaicin）等化合物，但前三者含量之和占辣椒素类物质总量的90%以上，其含量的高低直接影响着辣椒及其制品的辣度和疗效；因此，准确测定这3种辣椒素类物质的含量是评价辣椒及其制品质量的重要依据，也是保障辣椒新品种选育和推动辣椒深加工研究的重要技术支撑。

目前，对于辣椒素类物质含量的检测方法有比色法、薄层色谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱法[4-8]，其中以高效液相色谱法的应用最为广泛。国家标准GB/T 21266——2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素类物质测定及辣度表示方法》和行业标准NY/T 1381——2007《辣椒素的测定 高效液相色谱法》亦是采用此方法，但该方法对测定目标物只能依靠保留时间定性，易受样品中其他共存成分干扰而造成假阳性或假阴性结果，缺乏准确的定性功能，且这两项标准均采用甲醇-四氢呋喃的混合溶液作为提取溶剂，毒性较大。近年来，随着质谱的快速发展，高效液相色谱-串联质谱联用（HPLC-MS/MS）兼顾高效液相的高效分离功能，且MS/MS的多重反应监测（MRM）扫描能够进一步排除基质干扰，为目标化合物的准确定性与定量分析提供了可靠依据。为此，本文建立了辣椒中辣椒素类物质的液相色谱-串联质谱测定方法，优化其样品前处理及色谱条件，考察了方法的精密度与线性范围等，以期为准确评价辣椒及其制品质量、保障辣椒新品种选育和推动辣椒深加工研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Agilent 1260/G 6420型液相色谱-串联质谱联用仪（配ESI源）；Eppendorf 5810R型高速冷冻离心机；Sartorius BP 211D型电子天平；Millipore Milli-Q型超纯水器；XW-80A型漩涡混合器；KH-5000DE型数控超声波清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司）；液氮冷冻粉碎机（FDV，祐麒机械有限公司）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 材料与试剂

材料与试剂：甲醇和甲酸（美国Sigma-Aldrich公司），色谱纯；无水乙醇（成都科龙化工试剂厂），分析纯；辣椒素、二氢辣椒素和降二氢辣椒素（中草药标准物质研究中心），对照品。

样品：市售干辣椒，编号A。

辣椒素类物质标准储备液：分别准确称取适量的辣椒素、二氢辣椒素、降二氢辣椒素对照品于10mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，于4℃下保存，有效期为2个月。使用时根据需要稀释成适当质量浓度的系列标准工作溶液。

1.3 样品前处理

新鲜辣椒于60℃下烘干24 h后用液氮粉碎机粉碎，混匀，干辣椒直接用液氮粉碎机粉碎，混匀。准确称取0.10g（精确到0.0001g）辣椒粉末于50mL离心管中，加入15 mL无水乙醇，超声提取30min，6000r/min下离心10min，上层清液转移至50mL容量瓶中，再重复操作两次，合并3次提取液，无水乙醇定容，混匀，取1 mL提取液经0.22 μm尼龙滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱联用仪测定。

1.4 液相色谱与质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱（2.1mm×100mm，2.7μm）；流动相：A为0.1%的甲酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序见表1；流量：0.2 mL/min；色谱柱温度：40℃；进样量：1μL。

表1 梯度洗脱表

1.4.2 质谱条件

离子源：ESI源，正离子模式；扫描方式：多重反应监测（MRM）；干燥气（N2）温度：350℃；雾化气（N2）压力：25psi（1psi=6.894kPa）；干燥气流量：10.0L/min；喷雾电压：4 000 V；3种辣椒素的质谱分析参数见表2。

表2 3种辣椒素的MRM质谱分析参数

2 结果与验证

2.1 方法专属性验证

准确称取辣椒样品A 1份，按照本文方法进行前处理，制得样品溶液。分别取乙醇（空白溶液）、标准工作溶液、样品溶液、样品溶液加标准工作溶液进行测定，考察本方法的专属性，谱图如图1所示。结果表明，3种辣椒素类物质峰形尖锐、对称，保留时间稳定，空白溶液和样品溶液对3种辣椒素类物质的分离和测定无干扰，表明本方法具有良好的专属性，适合辣椒中辣椒素、二氢辣椒素和降二氢辣椒素3种辣椒素类物质的测定。

图1 乙醇、标准工作溶液、样品溶液和样品溶液加标准工作溶液的MRM图

2.2 方法灵敏度验证

分别取适量的辣椒素类物质标准储备液，用无水乙醇稀释成不同浓度的辣椒素类物质单一标准工作溶液，按照本文方法进行测定，以信噪比法考察本方法的灵敏度。以3倍信噪比（3S/N）确定本文方法中降二氢辣椒素和辣椒素的检出限为0.15mg/kg，二氢辣椒素的检出限为0.075mg/kg；以10倍信噪比（10S/N）确定本文方法中降二氢辣椒素和辣椒素的定量限为0.5mg/kg，二氢辣椒素的定量限为0.25mg/kg，表明本方法具有良好的灵敏度。

2.3 方法线性与范围验证

取适量的辣椒素类物质混合标准工作溶液，用无水乙醇逐级稀释成质量浓度为10000.0，5000.0，2500.0，1000.0，500.0，250.0，100.0，50.0，25.0，10.0，5.0，2.5，1.0，0.5 ng/mL的系列标准工作溶液，按照本文方法进行测定，以峰面积y与对应的质量浓度x（ng/mL）绘制标准工作曲线，考察方法的线性与范围。结果表明，降二氢辣椒素和辣椒素质量浓度在1.0～10000.0ng/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系，其中辣椒素的线性方程为y=99.026 442x-14.955 745，相关系数为0.999 9；降二氢辣椒素的线性方程为y=183.237915x-79.126037，相关系数为0.9998；二氢辣椒素质量浓度在0.5～10000.0ng/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系，其线性方程为y=201.102776x-14.346401，相关系数为0.9999；表明本文方法具有良好的线性与范围。

2.4 方法准确度验证

准确称取辣椒样品A 12份，等分成4组，其中3组分别添加适量不同浓度的辣椒素类物质混合标准溶液，按照本文方法进行测定，考察方法的准确度，测定结果见表3。由表可知，本文方法测定辣椒中3种辣椒素类物质的平均回收率在96.8%～104.0%之间，相对标准偏差均<5%，具有良好的准确度。

表3 方法准确度测定结果（n=3）

2.5 方法精密度验证

准确称取辣椒样品A 6份，按照本文方法进行测定，连续3天重复测定，考察方法的日内精密度和日间精密度，测定结果见表4。由表可知，本文方法测定辣椒中3种辣椒素类物质的日内和日间精密度相对标准偏差均<5%，具有良好的精密度。

表4 方法精密度测定结果

2.6 方法稳定性验证

准确称取辣椒样品A 1份，按照本文方法进行前处理，待测液分别于室温下放置1，2，4，8，12，24，48，72 h后进行测定，考察方法的日内稳定性和日间稳定性，测定结果见表5。由表可知，本文方法测定辣椒中3种辣椒素类物质的日内和日间稳定性相对标准偏差均<5%，具有良好的稳定性。

表5 方法稳定性测定结果

3 结束语

本文考察了辣椒样品中辣椒素类物质的测定方法，优化了色谱条件和质谱参数，方法的加标回收率为96.8%～104.0%，相对标准偏差均<5%，检出限为0.075～0.15mg/kg，定量限为0.25～0.5mg/kg，具有操作简单、灵敏度高、准确性好、线性范围宽、所用试剂毒性小等优势，可很好地满足辣椒中辣椒素、二氢辣椒素和降二氢辣椒素3种辣椒素类物质的测定，可为准确评价辣椒及其制品质量、保障辣椒新品种选育和推动辣椒深加工研究提供技术支撑。

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（编辑：莫婕）

Study on the determination of capsaicinoids in capsicum by LC-MS/MS

ZOU Yan，FENG Dejian，SHI Xiefei，LI Huaiping，TAN Heping
（Standard and Testing Technology of Tea Key Laboratory of Sichuan Province，National Institute of Measurement and Testing Technology，Chengdu 610021，China）

A method wasproposed forthedetermination ofcapsaicinoidsincludecapsaicin，dihydrocapsaicin and nordihydrocapsaicin in capsicum by LC-MS/MS.Capsaicinoids in capsicum were ultrasonically extracted with ethyl alcohol for three times，with 0.1%formic acid aqueous solution and methanol as mobile phase（gradient elution）.The capsaicinoids was analyzed by LCMS/MS in multiple reaction monitoring（MRM）mode and the extract was quantified by the external standard method.The results showed that a good linearity was obtained for nordihydrocapsaicin and capsaicinoids concentration in the range of 1.0-10000ng/mL，and dihydrocapsaicin on centration in the range of 0.5-10 000 ng/mL the average recoveries of perchlorate ranged from 96.8%to 104.0% with RSDs of less than 5%.The detection limit of capsaicinoids were 0.075-0.15 mg/kg，and the quantitation limit of capsaicinoids were 0.25-0.5mg/kg.The method is suitable for the determination and quality control of capsaicinoids in capsicum featuring simple operation，low toxicity，high sensitivity，good repeatability;wide linear range and other obvious advantages.

capsicum；capsaicin；dihydrocapsaicin；nordihydrocapsaicin；LC-MS/MS

A

：1674-5124（2016）12-0060-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.12.013

2016-08-22；

：2016-09-30

国家重点研发计划项目（2016YFF0202305）；四川省科技支撑计划项目（2009NZ0015，2013NZ0040，2015GZ0084）

邹 燕（1983-），女，四川中江县人，助理研究员，从事食品安全检测技术与标准研究。

谭和平（1957-），男，重庆市人，研究员，享受国务院政府津贴专家，从事生物化学茶产业链研究。