提高发酵牛粪有机肥有机氮含量的条件优化

武金霞，赵朋飞，张贺迎

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定071002； 2.河北大学 生物技术研究中心，河北 保定071002)

提高发酵牛粪有机肥有机氮含量的条件优化

武金霞1，赵朋飞1，张贺迎2*

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定071002； 2.河北大学 生物技术研究中心，河北 保定071002)

利用外源微生物进行牛粪发酵试验，研究了原料配比、菌种配比、C/N、发酵温度、发酵时间等条件对牛粪发酵过程中有机氮含量的影响，以期为大量堆肥生产试验及研究提供参考。结果表明，当黑曲霉3324∶绿色木霉JD-1∶产朊假丝酵母C-1︰假丝酵母F-2的体积比为1∶3∶3∶3，牛粪与玉米秸秆质量比为3∶1，C/N为22，培养温度为30 ℃，发酵时间为4 d时，有机氮含量最高，为2.38%。

牛粪； 玉米秸秆； 混菌发酵； 有机氮； 有机肥

随着人们对畜禽类产品的需求增加，畜禽养殖业规模不断扩大，粪便产生量也急剧上升。畜禽粪便中含有大量氮、磷、重金属、病原体及挥发性硫化氢、氨气等恶臭气体，直接排放会造成严重污染[1-2]。因此，需要对畜禽粪便进行资源化处理。目前，对畜禽粪便进行资源化处理的方法主要有沼气发酵、粪便饲料化和堆肥等，其中堆肥因具有成本低、耗时短、可就地处理以及生物风险小等特点被认为是较具可行性的方法[3]。

牛粪含水量高，分解慢，在高温堆肥过程中氮素损失严重，主要以氨气的形式挥发，导致堆肥产品氮素(主要以有机氮形式存在)含量低，影响肥力[4-5]。因此，需要提高牛粪堆肥有机氮含量。马丽红等[6]在牛粪中添加木霉和鸡粪以利于氨基糖态氮和氨基酸态氮的积累，使有机氮含量分别比初始增加4.5%和2.2%。黄懿梅等[7]研究表明，添加5.5%的果园土壤和炉渣，均可以降低高温期水溶性氨氮的浓度，并利于后期硝态氮和有机氮的形成，有机氮浓度增幅分别为82.4%和84.2%。黄懿梅等[8]在堆肥中引入FM菌和EM菌，对水溶性铵态氮的转化和水溶性有机氮的形成有明显的促进作用。但利用纤维素降解菌与假丝酵母协同发酵牛粪提高有机氮含量的研究报道较少[9]。为此，本研究选用纤维素降解菌和假丝酵母进行牛粪发酵试验，对原料配比、菌种配比、C/N、发酵温度、发酵时间等进行优化，以期提高发酵牛粪有机氮含量，弥补氮损失，提高肥料肥力，并为后期大量堆肥生产试验及研究提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 牛粪及秸秆 试验所用新鲜牛粪由河北省保定市养牛农户提供，玉米秸秆取自内蒙古赤峰市敖汉旗地区，秸秆经晒干后粉碎至0.4～1.0 cm。牛粪、秸秆的主要特性见表1。

表1 牛粪、玉米秸秆主要特性

注：各物质含量均以干物质计。

1.1.2 菌种及培养基 纤维素降解菌株绿色木霉(Trichodermaviride)JD-1、黑曲霉(Aspergillusniger) 3324及产单细胞蛋白菌株产朊假丝酵母(Candidautilis)C-1、假丝酵母(Candidaalbicans)F-2均为河北大学生物技术研究中心发酵与食品工程研究室保存。

斜面培养基：马铃薯200 g去皮，切成块煮沸30 min，用纱布过滤，再加糖20 g、琼脂20 g，补水至1 000 mL，121 ℃灭菌30 min。

种曲培养基：麸皮100 g 、玉米粉10 g、豆粕5 g、CaCl20.4 g、MnSO40.04 g、KH2PO40.2 g、激活剂0.2 g、水110 mL，121 ℃灭菌30 min。

麸皮培养基：麸皮100 g、水100 mL，121 ℃灭菌30 min。

玉米芯麸皮培养基：玉米芯︰麸皮为7∶3，料水比为1∶2，(NH4)2SO4添加量为2%，121 ℃灭菌30 min。

YPD培养基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，pH值 5.0～5.4，115 ℃灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 假丝酵母的培养 从保存的斜面菌种上接2环至装有30 mL YPD培养基的100 mL三角瓶中，28 ℃、50 r/min培养24 h左右。以5%接种量接种到装有125 mL YPD培养基的500 mL三角瓶中，28 ℃、80 r/min培养14 h。再进一步扩大培养，得假丝酵母发酵液。

1.2.2 霉菌的培养 从保存的斜面菌种上接2～3环至装有1/3管种曲培养基的试管中，30 ℃斜放培养，黑曲霉培养24 h，木霉培养48 h。然后转接到装有约1 cm厚种曲培养基的500 mL三角瓶内，每瓶0.2 g，30 ℃培养。曲料第1次结块将其摇碎，再次结块时拍瓶底，使其与瓶底分离，斜放培养，黑曲霉培养2 d，木霉培养3 d，干燥，得种曲。

向装有厚为2～3 cm培养基的浅盘中接种0.3%的种曲，黑曲霉为麸皮培养基，木霉为玉米芯麸皮培养基，盖上湿布，30 ℃培养。曲料第一次结块将其打碎，铺平继续培养，黑曲霉培养2 d，绿色木霉培养4 d，干燥，供后续发酵牛粪使用。

1.2.3 牛粪发酵试验 以新鲜牛粪和玉米秸秆为原料，接种复配菌剂，物料装于500 mL三角瓶内，厚约1 cm，置培养箱内培养，分别考察原料配比、菌种配比、C/N、发酵温度、发酵时间等对发酵牛粪有机氮含量的影响。在菌种复配时，霉菌以培养物质量计，酵母以菌液体积计。

1.2.3.1 原料配比对发酵牛粪有机氮含量的影响 调节原料含水率为60%，再以尿素调节C/N 为30，接种按照1∶1∶1∶1(体积比，下同)配制的黑曲霉3324、绿色木霉JD-1、产朊假丝酵母C-1、假丝酵母F-2的菌剂，30 ℃培养4 d，考察原料配比(1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4.5∶1)对发酵牛粪有机氮含量的影响。

1.2.3.2 菌种配比对发酵牛粪有机氮含量的影响 在确定原料配比后，调节原料C/N 为30，含水率为60%，接种菌剂后于30 ℃培养4 d，考察菌种配比(1∶1∶1∶1、1∶2∶2∶2、1∶3∶3∶3、2∶1∶2∶3、2∶2∶3∶1、3∶1∶3∶2)对发酵牛粪有机氮含量的影响。

1.2.3.3 C/N对发酵牛粪有机氮含量的影响 在确定原料和菌种配比后，以尿素调节原料至不同的C/N比值，尿素以少量温水溶解加入，再调节含水率为60%，30 ℃培养4 d，考察C/N(20、22、24、26、28、30)对发酵牛粪有机氮含量的影响。

1.2.3.4 发酵温对发酵牛粪有机氮含量的影响度 在以上原料配比、菌种配比、C/N的基础上，调节含水率为60%，分别置发酵体系于不同温度(25、30、35、40、45、50 ℃)下发酵4 d，考察发酵温度对发酵牛粪有机氮含量的影响。

1.2.3.5 发酵时间对发酵牛粪有机氮含量的影响 在以上优化后的试验基础上进行操作，每天测定发酵牛粪有机氮含量，考察发酵时间(0、1、2、3、4、5、6、7、8 d)对发酵牛粪有机氮含量的影响。

1.3 测定指标及方法

全氮含量采用凯氏定氮法测定[10]；铵态氮含量：将样品加水浸提30 min，固液比为1∶10，过滤后取滤液10 mL置于凯氏定氮仪上蒸馏、滴定，计算铵态氮含量。有机氮含量=全氮含量-铵态氮含量。

2 结果与分析

2.1 原料配比对发酵牛粪有机氮含量的影响

牛粪水分含量较高，空隙较小，空气不足，发酵时易处于厌氧状态，不利于好氧微生物的生长，从而减慢有机质分解速度，延长堆肥时间，并产生H2S等恶臭气体；另外，牛粪C/N也不适宜。因此，添加玉米秸秆作为调理剂。由图1可以看出，有机氮含量随着牛粪添加量的增加先上升后下降，当牛粪∶秸秆为3∶1时，有机氮含量最高；当牛粪∶秸秆大于3∶1时，有机氮含量下降。这是因为随着牛粪添加量的增加，牛粪中一些可供微生物直接利用的简单物质如葡萄糖、氨基酸、铵态氮等的含量增加，促使假丝酵母大量繁殖，有机氮含量增加；但牛粪含水量较大，质地黏稠，随着牛粪添加量继续增加，发酵物料的空隙减少，溶氧量下降，抑制微生物代谢活动，进而有机氮含量下降。综上，牛粪∶秸秆为3∶1时最佳。

图1 不同原料配比对发酵牛粪有机氮含量的影响

2.2 菌种配比对发酵牛粪有机氮含量的影响

由图2可知，在黑曲霉3324∶绿色木霉JD-1∶产朊假丝酵母C-1∶假丝酵母F-2为1∶3∶3∶3时，有机氮含量最高，为2.08%。因为黑曲霉、绿色木霉可分泌纤维素酶，纤维素酶可将纤维素等物质分解成一些小分子物质，作为2种酵母的营养物质，使其大量繁殖生产单细胞蛋白；同时，这些小分子物质被消耗掉后，也消除了这些物质对酶合成的阻遏作用及对酶解过程的反馈抑制，而且还为霉菌提供一定的氮素营养，促进其生理活动，具有协同作用。综上，黑曲霉3324∶绿色木霉JD-1∶产朊假丝酵母C-1∶假丝酵母F-2为1∶3∶3∶3时效果最佳。

图2 不同菌种配比对发酵牛粪有机氮含量的影响

2.3 C/N对发酵牛粪有机氮含量的影响

由图3可知，随着C/N的增加，有机氮含量先升高后降低并逐渐趋于平稳，当C/N为22时，有机氮含量最高，为2.33%。碳为微生物提供能源和组成细胞的主要物质，氮是构成蛋白质、核酸、酶等的重要元素。微生物生长繁殖需要适宜的C/N，随着C/N的升高，微生物的繁殖因能量不足受到的抑制作用减弱，过剩氮素转变成NH3而挥发的数量减少，有机氮含量增加；C/N再升高，氮素养料逐渐缺乏，微生物活动受到抑制，导致有机氮含量下降。综上，C/N为22时效果最佳。

图3 不同C/N对发酵牛粪有机氮含量的影响

2.4 发酵温度对发酵牛粪有机氮含量的影响

微生物进行代谢活动对温度有一定的要求。由图4可知，有机氮含量随着发酵温度的升高先上升后下降最终趋于平稳，其在30 ℃达到最高，为2.35%，35 ℃以后趋于稳定。这可能是因为温度升高逐渐接近适宜温度，微生物生长越来越活跃，有机氮含量增加；温度继续升高，微生物的活动逐渐受到抑制，有机氮的生成量减少，渐渐与其分解利用量趋于平衡。综上，发酵温度为30 ℃时效果最佳。

图4 不同发酵温度对发酵牛粪有机氮含量的影响

2.5 发酵时间对牛粪有机氮含量的影响

由图5可知，随着发酵时间延长，菌体生长、细胞数量增加，进而有机氮含量也逐渐增加，发酵4 d时达到最大，为2.38%，而后缓慢减少，这可能是因为有一部分酵母细胞死亡自溶，其菌体蛋白释放出来被其他菌体消耗利用，或转化为NH3挥发，从而导致有机氮含量降低。综上，发酵时间为4 d时效果最佳。

图5 不同发酵时间对发酵牛粪有机氮含量的影响

3 结论与讨论

在堆肥生产过程中，堆肥的前期为中温阶段(15～45 ℃)，在此阶段微生物分解有机质等物质产生的热量使堆体温度逐渐上升，其升温所需时间因工艺不同而不尽相同，3、4 d到10 d不等[15-17]。本研究结果表明，接种的复配菌剂在25～50 ℃时均对发酵体系中有机氮含量有一定程度的影响，并且在4 d时有机氮含量到达顶点，故可以考虑将以上菌种接种于堆肥前期，应用到堆肥生产中。

本研究确定了牛粪发酵的最佳工艺条件，即黑曲霉3324∶绿色木霉JD-1∶产朊假丝酵母C-1∶假丝酵母F-2为1∶3∶3∶3，牛粪、玉米秸秆比例为3∶1，C/N为22，培养温度为30 ℃，发酵时间为4 d，在该条件下，有机氮含量达到2.38%，对发酵牛粪有机肥的生产试验奠定了基础，但发酵过程中氮素形态的变化规律研究有助于了解氮素转化过程，对提高有机氮含量至关重要，可在后续大量堆肥研究中加强。

[1] 部丽英.畜禽粪便对环境的影响及利用探索[J].中国动物保健，2015，17(5):16-17.

[2] Maeda K，Morioka R，Hanajima D，etal.The impact of using mature compost on nitrous oxide emission and the denitrifier community in the cattle manure composting process[J].Microbial Ecology，2010，59(1):25-36.

[3] 廖青，韦广泼，江泽普，等.畜禽粪便资源化利用研究进展[J].南方农业学报，2013，44(2):338-343.

[4] 国辉，袁红莉，耿兵，等.牛粪便资源化利用的研究进展[J].环境科学与技术，2013，36(5):68-75,107.

[5] Mulbry W,Westhead E K,Pizarro C,etal.Recycling of manure nutrients: Use of algal biomass from dairy manure treatment as a slow release fertilizer[J].Bioresource Technology，2005，96(4):451-458.

[6] 马丽红，黄懿梅，李学章，等．两种添加剂对牛粪堆肥中氮转化及相关微生物的影响[J]．干旱地区农业研究，2010，28(1)：76-82,110．

[7] 黄懿梅，苟春林，梁军峰.两种添加剂对牛粪秸秆堆肥化中氮素损失的控制效果探讨[J].农业环境科学学报，2008，27(3):1219-1225.

[8] 黄懿梅，曲东，李国学，等.两种外源微生物对鸡粪高温堆肥的影响[J].农业环境保护，2002，21(3):208-210.

[9] 郭夏丽，张静晓，王静，等.菌渣和牛粪联合堆肥中的氮素转化研究[J].郑州大学学报(工学版)，2012，33(1):71-74.

[10] 武金霞.生物化学实验教程[M].北京：科学出版社，2012：167-171.

[11] Lhadi E K，Tazi H，Aylaj M，etal.Cocomposting epara-ted MSW and poultry manure in Morocco[J].Compost Science & Utilization，2004，12(2):137-145.

[12] 张玉兰，孙彩霞，段争虎，等.堆肥原位保氮技术研究进展[J].土壤通报，2010，41(4):1000-1004.

[13] Kuroda K，Hanajima D，Fukumoto Y，etal.Isolation of thermophilic ammonium-toleran bacterium and its application to reduce ammonia emission during composting of animal wastes[J].Bioscience Biotechnology Biochemistry，2004，68(2):286-292.

[14] 黄向东，韩志英，石德智，等.畜禽粪便堆肥过程中氮素的损失与控制[J].应用生态学报，2010，21(1):247-254.

[15] 林清，陈敏艳.牛粪有氧发酵的处理方法[J].中国牛业科学，2012，38(4):76-77.

[16] 赵洪颜，李杰，刘晶晶，等.沼液堆肥化与牛粪堆肥化的发酵特性及腐熟进程[J].农业环境科学学报，2012，31(11):2272-2276.

[17] 高建程，于金莲，石登荣，等.不同预堆期对牛粪堆肥进程的影响研究[J].农业环境科学学报，2008，27(3):1214-1218.

Optimization of Conditions of Improving Organic Nitrogen Content of Fermented Cow Manure

WU Jinxia1,ZHAO Pengfei1,ZHANG Heying2*

(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002，China;2.Research Center for Biotechnology, Hebei University,Baoding 071002，China)

The experiment of cow manure fermentation by inoculating exogenous microbes were performed, and the effects of the raw material ratio, strains ratio, C to N ratio, culture temperature and fermentation time on the organic nitrogen content in cow manure were studied, so as to provide a reference for a large number of compost production experiments and research. The results showed that when the ratio ofAspergillusniger3324 toTrichodermavirideJD-1 toCandidautilisC-1 toCandidaAlbicansF-2 was 1∶3∶3∶3, the ratio of cow manure to corn stalks was 3∶1, the ratio of C to N was 2∶1, culture temperature was 30 ℃, fermentation time was 4 d, the organic nitrogen content was the highest with 2.38%.

cow manure; corn stalks; mixed bacteria fermentation; organic nitrogen; organic fertilizer

2015-11-25

河北省生物工程重点学科项目(1050-5030023)

武金霞(1966-)，女，河北保定人，教授，博士，主要从事微生物学及应用研究。E-mail：wjx6@163.com

*通讯作者：张贺迎(1966-)，男，河北大城人，副研究员，本科，主要从事微生物发酵及应用研究。 E-mail：z660128@163.com

S141.4

A

1004-3268(2016)03-0078-04