血清（尿）钙检测方法中影响因素的综述

靳丹虹，梁芳慧，牛艳秋，董丽丹，蔺首睿，高雅静长春医学高等专科学校，吉林长春　130031

血清（尿）钙检测方法中影响因素的综述

靳丹虹，梁芳慧，牛艳秋，董丽丹，蔺首睿，高雅静
长春医学高等专科学校，吉林长春130031

血清（尿）钙检测能为临床评价病患肌体钙离子的代谢水平和疾病诊断提供重要的参考依据。通过对临床常用血清（尿）钙检测的基本原理、影响测定结果的因素及改进措施等关键问题进行探讨，为血清（尿）钙检测方法的改进和临床准确检验提供参考。

尿钙；血清钙；检测方法

［Abstract］Serum（urine）calcium detection can provide important reference basis for clinical evaluation of metaboilic level of body calcion of patients and disease diagnosis.The paper provides reference for the improvement and clinical accurate test of the serum （urine）calcium detection method by studying the key issues of the basic principle of the common serum （urine）calcium detection in clinic，influencing factors of test results and improvement measures.

［Key words］Urine calcium；Serum calcium；Test method

血清（尿）钙的检测是临床常用的化验项目，血清（尿）钙的变化能反映机体钙的代谢变化，血清钙和尿钙的变化具有一定的相关性，两者对疾病的诊断、监测和治疗具有重要的临床意义［1］。血清（尿）钙检测方法有多种，但是未见对分析原理和检测结果准确度产生影响的各因素的探讨。每种分析方法由于原理不同，血清（尿）标本成份复杂，存在的影响因素也各有差异。因此，有必要对临床检测过程中的各影响因素进行探讨，为技术开发人员和化验室分析人员对血清（尿）钙检测方法的改进和化验室的临床准确检测提供参考。

1　EDTA滴定法

乙二胺四乙酸二钠盐简称EDTA。标本中的钙离子在碱性溶液中与钙红指示剂结合生成可溶性的红色络合物，使溶液呈淡红色；当用EDTA滴定液滴定已加入少量钙红指示剂的标本时，EDTA先与游离的钙离子反应，当游离钙离子较少时EDTA夺取红色化络合物中的钙，钙红指示剂游离，溶液的颜色由钙红指示剂—钙络合物的红色转变为钙红指示剂的蓝色停止滴定。根据血清（尿）的体积、EDTA滴定液的浓度和消耗的体积计算钙的含量。EDTA滴定法能准确反映肌体24 h钙的代谢变化值［2］。EDTA滴定法中用10%的NaOH溶液调pH 12～13，在此pH下镁离子生成沉淀可以避免对钙测定的干扰。钙红指示剂在碱性环境中不稳定褪色快，导致终点不易掌握，在NaOH中加入硫脲作为稳定剂可以提高钙红指示剂在碱性环境中的稳定性，延长退色时间。血清中少量的Mg2+，Hb，总胆红素，脂浊对测定无影响［2-3］。

2　甲基百里香酚蓝比色法

甲基百里香酚兰（又称甲基麝香草酚兰，MTB）是一种优良的金属络合剂。钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝结合生成蓝色的络合物，利用蓝色络合物在可见光区对光的吸收值与标本中钙的量成正比。甲基百里香酚蓝比色法已有试剂盒在临床使用［4］。标本中加入8-羟基喹啉能消除镁离子对测定的干扰，标本中NaCl的浓度变化对血清钙离子的测定有一定影响，离子强度增加钙离子的测定产生正误差，血清中少量的Mg2+、Hb、总胆红素、脂浊对测定无影响［5］。

3　邻甲酚酞络合酮法

邻甲酚酞络合酮法为中等实验室测定血清钙的常规方法，邻甲酚酞络合酮（OCPC）在碱性溶液如二乙胺中能与钙络合生成OCPC-钙紫红色络合物，OCPC-钙紫红色络合物在575～600 nm附近有吸收峰，吸光度值与钙的量成正比，络合物的吸光度值在1 h内稳定［6］。

试剂8-羟基喹啉可以掩蔽镁离子，8-羟喹啉易被氧化失去掩蔽Mg2+的作用，故工作液应新鲜配备使用或配成酸性储备液试剂中加入KCN可以掩蔽Mg2+以外的其他重金属，增加反应稳定性［7］。孙庆艳等［8］的研究表明，碱性条件下邻甲酚酞络合酮不稳定，加入二甲基亚砜作为稳定剂，亦可使轻度脂血标本反应液澄清，并可消除蛋白影响。该法中钙的测定结果与血液pH值呈负相关，样本暴露于空气中会引起pH变化，因此最好实时检测。

试剂盒所需试剂的加入顺序对测定结果有一定的影响［9］，针对不同的产品在投入临床检验前应对试剂的加入顺序做对比研究。采用全自动生化仪测定钙时有研究发现［10-11］测定其他项目使用的胱抑素C（CysC）试剂，尿酸酶-过氧化物酶偶联法试剂等对钙的测定有干扰。因此使用全自动生化分析仪时要注意对每项检测所用器皿进行彻底清洗，避免交叉污染。

4　偶氮胂Ⅲ法

游离的偶氮胂Ⅲ（ArenazoⅢ）呈紫红色，在碱性条件下ArenazoⅢ与钙络合形成蓝紫色ArenazoⅢ—钙的络合物。当用EDTA滴定有少量ArenazoⅢ指示剂的标本时，EDTA与游离钙结合完毕后，继续滴入的EDTA将夺取ArenazoⅢ—钙络合物中的钙，ArenazoⅢ—钙络合物被解离，在660 nm附件反应液吸光度的下降值与钙浓度在一定范围内成正比，吸光度值在1 h内稳定。

血清钙检测过程中黄疸较深、乳糜血的标本采用氮胂Ⅲ法测定时应做样本空白对照试验，少量的胆红素、结合胆红素、乳糜、抗坏血酸、血红蛋白对实验无明显干扰［12］。采用全自动生化仪分析时其他测定项目中加入的生化试剂、酶类试剂或有酶促反应的试剂中所添加的EDTA、EGTA、柠檬酸盐等螯合剂，若处理不当易发生交叉污染，标本盛放器皿选择不当对测定亦能产生干扰［13-15］。

5　酶法分析

酶的选择性高，一般酶只催化一种反应，或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起作用［16］。Ca2+激活的猪胰腺α一直链淀粉酶方法，标本中的Ca2+可激活α-淀粉酶反应体系产生CNP，CNP浓度的增加与钙离子浓度成正比关系，监测反应体系405 nm处吸光度的变化可以获得血清（尿）中Ca2+的含量。

脲酰胺酶（EC3，5，1，4，5）谷氨酸脱氢酶（GLDH，EC1，4，1，4）测定血清钙和尿钙。其反应机理可能是钙影响了酶-ATP-Mg复合物对尿素的羧化，钙和镁以及钙和三磷酸腺苷（ATP）之间的抑制是非竞争性的，这种酶的抑制作用与钙离子浓度成正比，检测340 nm处的吸光度变化可以获得钙离子浓度［17］。

猪胰腺α一直链淀粉酶法不受各种正离子特别是镁离子、血清蛋白及其他物质的影响，为了消除氯的影响，防止Ca2+与淀粉酶的过快结合在试剂中加入适量的NaCl和络合剂BAPTA，GEDTA等［16］。采用脲酰胺酶（EC35.1.45）谷氨酸脱氢酶（GLDH.EC1.4.1.4）测定血清钙，适宜的pH7.5～8.0，可以排除内源性铵离子的干扰。试剂中加入适量NaCl及综合剂（如GEDTA）可消除Cl-的干扰，调整Ca2+与酶的结合速度。脲酰胺酶法测定血清钙时标本的黄疸较深和乳糜血等对结果影响较大，溶血、重度黄疸、严重脂血的标本应做样本空白对照试验，少量的NH4+、Mg2+对测定无干扰［17］。

6　离子选择电极法

钙电极是对离子钙活度具有选择性电位响应的一种离子选择性电极。杨宪园等［18］采用离子选择电极法测定血清和尿液中钙离子浓度对失重性骨丢失进行评价。标本的pH对血清（尿）钙测定结果有一定影响［19-22］。尿液在空气中长时间放置pH值会升高将引起离子平衡的移动，导致尿离子钙浓度下降，因此尿样在分析前不宜在空气中曝露放置过久。血清样本在酸性条件下会促使蛋白结合钙解离，使得测得的钙浓度增高。当被测血清样本的pH值偏碱性时，离子钙和其他成分结合加强，使测得的血清钙浓度降低。在实际工作中血液样本长时间暴露在空气中会导致pH值升高，此外体液酸碱紊乱患者的血清样本直接测定血清（尿）钙亦存在误差，对上述情况将样本pH值校准到7.4的标准离子钙值能增加测定结果的准确度。该方法不受溶血、黄疸、脂血的干扰。

磷浓度对离子钙的测定有明显的负影响，磷的浓度达到或超过2.5 mmol/L时离子钙测定结果明显受到影响，此时临床要综合考虑测定所用的方法、血磷的浓度等情况来指导临床的诊断和治疗［22］。

7　原子吸收光谱法

原子吸收法是用于微量元素检测的金典方法，在临床应用广泛［23］。标本中钙元素对其特征谱线光的吸收强度与其量在一定条件下呈线性关系，因此利用原子吸收分光光度计可以对血清（尿）中的钙进行定量分析。

在尿中存在着多种离子，在原子化过程中，可以形成稳定的酸性复合物，从而降低钙的原子化率［24］。邓通洋等的研究［12，24］发现标本中加入试剂EDTA、SrCl2、氯化镧、硝酸锶等能消除尿液样本分析中的化学干扰，提高钙的原子化率，血清出现严重溶血不干扰测定结果。尿液较黄时，稀释可降低尿基质对钙测定的干扰［25］。

原子吸收法光谱仪在使用中还要注意，每天要对标准曲线、灯的能量等进行校正，选择合适的灯电流（最大工作电流的1/3～2/3左右）、燃烧器高度等仪器参数，确保检测的准确度［25］。

8　流动注射法

流动注射分析是一种管道化的连续流动分析法。它主要包括将标本溶液注入载流，标本溶液与载流试剂混合和发生反应，与载流混合反应后的标本在持续进入系统载流的推动下恒速地流进紫外或荧光检测器被检测3个过程。

文献报道［26］的流动注射法利用的载流与钙的显色剂有甲基麝香草酚蓝、钙色素等。甲基麝香草酚蓝显色法适宜的反应条件为:甲基麝香草酚蓝的浓度0.08 mmol/ L，8-羟基喹啉的浓度2.0 g/L，聚乙烯吡咯烷酮的浓度1.5 g/L，盐酸的浓度0.025 mol/L，无水亚硫酸钠的浓度6.0 g/L，单乙醇胺的浓度5.5%。钙色素显色法适宜的测定反应条件为:钙色素浓度为0.020%，氢氧化钾溶液0.020%。

临床检测前流动注射法要根据实验样品的吸光度（荧光）强度选择最佳的反应时间、反应管长度、载流流速等实验条件，来确保检测结果的准确度。

9　其他检测方法

对血清（尿）钙的检测方法还有苏氏试剂法、偶氮氯磷法等。荧光探针在其他体系中对钙的测定研究正在广泛开展［27-28］，试剂盒简便宜操作适用于家庭的日常快速检测［29］，未来或许会在血清（尿）钙的临床测定中广泛发挥作用。

10　结语

血清（尿）钙的检测方法多样，研发快速、准确、操作简单适用于临床准确检测和家庭日常定期、快速检测的仪器与试剂盒是检验仪器发展的目标。临床检验和分析仪器研发人员不但要掌握血清（尿）钙检测方法的原理，同时应注意排除化验中的各影响因素才能为临床提供稳定、准确、可靠的血清（尿）钙结果。

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Review of Influencing Factors in the Serum（Urine）Calcium Detection Method

JIN Dan-hong，LIANG Fang-hui，NIU Yan-qiu，DONG Li-dan，LIN Shou-rui，GAO Ya-jing
Changchun Medical College，Changchun，Jilin Province，130031 China

R446

A

1672-5654（2016）05（a）-0195-04

靳丹虹（1965-），女，吉林通化人，本科，教授，主要从事检验仪器分析、分析化学的教育与研究工作。

2016-01-28）