纳豆激酶生产菌的亚硝基胍诱变

臧学丽

（长春医学高等专科学校，吉林长春 130031）

纳豆激酶生产菌的亚硝基胍诱变

臧学丽

（长春医学高等专科学校，吉林长春 130031）

文章研究了产纳豆激酶枯草芽孢杆菌的亚硝基胍诱变。采用亚硝基胍为诱变剂诱变枯草芽孢杆菌，诱变后酶活达到4 100U/g，提高了122.2%，为进一步的发酵研究提供依据。

纳豆激酶 亚硝基胍 枯草芽孢杆菌

纳豆激酶（Nattokinase，NK）是由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto，BSN）产生的一种碱性蛋白酶，它具有溶解血栓的作用[1]。纳豆激酶具有安全、副作用少、成本低、易吸收[2]、在体内作用时间长等优点[3]，是一种具有开发潜力的溶栓药物。文章对产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌进行了化学诱变[4]，使纳豆激酶的活性得到显著提高。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株：纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto，BSN），长春医学高等专科学校生工试验室保藏。筛选培养基：纤维蛋白平板复筛培养基。

1.2 方法

1.2.1 生长曲线的测定

在37℃条件下以8%的接种量接种纳豆枯草芽孢杆菌于液体培养基中，在培养0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h后于600 nm波长的紫外可见分光光度计下测其OD值，3组平行并绘制生长曲线。

1.2.2 纳豆激酶活性测定

（1）纤维蛋白平板法：参照Astrup法[5]。

（2）纳豆中纳豆激酶活力测定。称取黄豆500 g，洗净加入2.5倍水，浸泡过夜，分装到250 ml三角瓶中，121℃高压灭菌0.5 h，自然冷却至50℃时以8%的接种量接上种子液，在37℃条件培养25 h。称取纳豆50 g，加入100 ml生理盐水，浸泡30 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液稀释一定的倍数，采用纤维蛋白平板法测定酶活。

1.2.3 枯草芽孢杆菌的诱变育种

培养纳豆枯草芽孢杆菌至菌株的对数期，4℃冷冻高速离心机中5 000 r/min离心5 min。利用生理盐水将菌泥均匀打散，并稀释至菌体浓度为1×108。取上述菌悬液1 ml，加入pH4.5的醋酸钠缓冲液2 ml，0.1 mol/L亚硝基胍溶液1 ml于37℃培养箱中分别黑暗孵育10、15、20、25 min后，向各样品中加入0.07 mol/L的pH8.6的磷酸盐缓冲液20 ml终止反应。取100μl的上述菌悬液涂布到筛选培养基中，37℃避光培养，并计算致死率。

致死率=（0 s时的菌落数-不同诱变时间的菌落数）/0 s时的菌落数×100%

计算在不同诱变剂量条件下的致死率，并制作致死率曲线，查找出致死率为80%～90%的致死剂量，并在最佳的致死剂量条件下进行诱变。

2 结果与讨论

2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线

通过试验可以得出，枯草芽孢杆菌的生长周期适中，8 h进入对数期，24 h后进入稳定期，延滞期较短，适合应用工业发酵生产。

2.2 对纳豆枯草芽孢杆菌进行亚硝基胍诱变

致死剂量为80%～90%时，菌株的突变率最高，通过试验可看出，枯草芽孢杆菌在亚硝基胍的诱变时间为20 min时菌株的致死率为85%，所以该研究中选择的亚硝基胍诱变时间为20 min。对亚硝基胍诱变的菌种进行发酵，比较诱变前后的酶活，诱变后酶活达到4 100U/g，酶活提高了122.2%，诱变效果较好，经过10代的传代培养，诱变后菌株的遗传稳定性良好。

3 结论

枯草芽孢杆菌经过亚硝基胍诱变，酶活提高了122.2%，酶活达到4 100U/g。

[1] 李淑英，赵仲麟，聂莹，等．纳豆激酶研究进展．中国农业科技导报，2013，（4）：139～143

[2] He Ni，Peng-Cheng Guo，Wei-Ling Jiang，et al．Expression of nattokinase in Escherichia coli and renaturation of its inclusion body．Journal of Biotechnology，2016

[3] 逯京华，孙智杰．纳豆激酶的研究现状与展望．生物技术通报，2009，（8）：41～45

[4] 王乐．纳豆激酶高产菌株筛选及发酵工艺优化研究．山东轻工业学院，2009

[5] Sumi．Experimentia，1987，43：1110～1111