糖尿病小鼠心肌组织中动力相关蛋白1的表达变化

荆哲，刘峰舟，陈永清，刘燕，陈冲，景策

(1.兰州军区兰州总医院心血管内科，兰州 730050；2.解放军九四一九五部队卫生队；3.解放军第四五一医院门诊部；4.第四军医大学西京医院内分泌科)



糖尿病小鼠心肌组织中动力相关蛋白1的表达变化

荆哲1，刘峰舟2，陈永清1，刘燕1，陈冲3，景策4

(1.兰州军区兰州总医院心血管内科，兰州 730050；2.解放军九四一九五部队卫生队；3.解放军第四五一医院门诊部；4.第四军医大学西京医院内分泌科)

目的 观察db/db糖尿病小鼠与正常小鼠心肌组织中动力相关蛋白1(Drp1)表达水平的变化。方法 9只雄性db/db糖尿病小鼠，随机分为6周组(db/db 6week)，12周组(db/db 12week)，18周组(db/db 18week)；另设健康组雄性小鼠9只，随机分为6周组(wt 6week)，12周组(wt 12week)，18周组(wt 18week)，每小组3只。分别利用实时定量PCR，Western Blot，免疫组织化学的方法检测心肌组织中Drp1的表达和定位。结果 db/db糖尿病小鼠分组中Drp1的表达低于健康组，且随年龄的增长表达逐渐降低。结论 糖尿病小鼠中Drp1表达进行性的降低，引起线粒体分裂异常从而导致线粒体的生物功能障碍，可能是糖尿病心肌病发生及发展的重要机制之一。

糖尿病,2型；心肌；动力蛋白质Ⅰ；线粒体,心脏；小鼠，近交DBA

糖尿病是一种以胰岛素分泌绝对或者相对不足为主要特征，表现为高血糖、高血脂的代谢紊乱性疾病[1]。随着人们生活水平的不断提高，发病率逐年增高，近年来流行病学调查发现，糖尿病患者中70%以上死于心血管相关性疾病，明显高于非糖尿病患者心血管系统疾病[2]。而其中糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者主要心脏并发症之一[3]。糖尿病心肌病是糖尿病引起心脏微血管病变和心肌代谢紊乱所致的心肌多处局灶性坏死[4]。早期主要表现为心肌顺应性下降和舒张功能不全，晚期以收缩功能不全为主要表现，严重时可发展为充血性心力衰竭[5]。

线粒体在细胞的生命进程中发挥着重要的生物学功能[6]，有研究显示，线粒体功能障碍对糖尿病心肌病的发生及发展起着直接作用[7]。其中线粒体融合与分裂这一动态平衡的稳定，对于维持线粒体自身生物学功能至关重要[8]。动力相关蛋白1(Drp1)是介导线粒体分裂的重要分子之一，又被称为DLP1(dynamin-like protein 1)，该分子为一个大GTP酶分子，结构为N端具有GTP酶结构域，C端为GTP酶效应结构域，中间为Dynamin同源结构域[9-10]。Drp1主要分布于细胞浆中，但其结构中的一部分在线粒体管状结构上呈点状分布，为线粒体的分裂位点[11]。虽然目前已有研究证实在心血管病相关事件中存在着线粒体分裂与融合的动力学改变[12-13]，但目前尚未见有关线粒体动力学相关研究在糖尿病心肌病中的报道。

本研究通过构建小鼠糖尿病心肌病模型，探讨不同周龄糖尿病心肌组织中Drp1的表达变化，期望进一步阐述糖尿病心肌病中心肌线粒体分裂与融合这一动力学变化在糖尿病心肌病发生及发展中的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 动物实验方法 根据实验设计，采用随机数字表法，将9只雄性db/db糖尿病小鼠随机分为3组，每组3只，分别饲养至6周(db-6W)，12周(db-12W)，18周(db-18W)；另将9只健康雄性小鼠分为三组，每组三只，分别饲养至6周(wt-6W)，12周(wt-12W)，18周(wt-18W)。动物购自常州卡文斯实验动物有限公司(动物许可证号：SCXK苏2011-0003)。饲养到对应周龄后处死，取心脏左心室组织供实验使用。

1.2 Western Blot检测Drp1蛋白表达水平 采用聚丙烯凝胶电泳(10%分离胶，5%浓缩胶)，80 V进行上层胶电泳，120 V进行下层胶电泳2 h后，采用湿转的法将蛋白转移到PVDF膜上(100 V恒压，1 h)。5%脱脂奶粉摇床室温封闭1 h，Drp1抗体(购自美国Santa cruz公司)稀释比例为1∶500，β-actin抗体(购自武汉三赢公司)稀释比例为1∶3000,4 ℃封闭过夜，兔二抗IgG抗体室温孵育2 h后，化学发光试剂盒进行检测。

1.3 实时定量PCR检测Drp1 mRNA表达水平 采用实时定量PCR方法对不同处理组中心肌组织Drp1的mRNA表达水平进行检测。Trizol(购自美国Invitrogen公司)法提取心肌组织的总RNA后反转录为cDNA。采用实时定量PCR法检测，严格按照PCR检测试剂盒的说明书操作(购自TaKaRa公司)。扩增Drp1基因的引物序列上游为：5'-CGTAGTGGGAACGCAGAG-3'，下游为5'- ACAGGCACCTTGGTCATT-3';扩增内参GAPDH基因的引物序列上游为：5'- GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游为5'- ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。

1.4 免疫组织化学检测Drp1的表达及定位 采用免疫组织化学方法对Drp1的表达水平进一步验证并观察其表达定位。Drp1稀释比例1∶100。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，柠檬酸钠高压煮沸3 min抗原修复，10%正常羊血清孵育，加一抗后4 ℃过夜，PBS缓冲液震荡清洗后分别滴加二抗及三抗，DAB显色，苏木素复染后，常规封片。

1.5 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件进行处理，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌组织Drp1 mRNA表达 分别饲养db/db及健康组小鼠6周，12周，18周后，采用实时定量PCR检测Drp1 mRNA表达。结果显示，db/db小鼠心肌组织中Drp1的mRNA水平明显低于健康组水平，且随着周龄的增长表达逐渐降低，见图1。

2.2 心肌组织 Drp1蛋白表达 为了进一步明确Drp1在糖尿病心肌组织中的表达情况，采用Western Blot检测Drp1在心肌组织中的蛋白表达水平。结果显示，db/db小鼠心肌组织中Drp1的蛋白表达明显低于健康组水平，且随着周龄的增长表达逐渐降低，这与实时定量PCR的结果相一致(图2)。

2.3 免疫组织化学 通过实时定量PCR及Western Blot检测明确了在db/db糖尿病小鼠中Drp1的mRNA及蛋白表达水平较健康组明显降低，为了进一步探究Drp1在心肌组织中的定位情况，采用免疫组织化学进行了检测。实验结果发现，阳性信号呈棕褐色颗粒，主要定位于细胞包浆中，部分定位于线粒体，与线粒体的排列位置相一致，呈珠串状，且在db/db糖尿病心肌组织中表达明显低于健康组(图3)。

3 讨论

糖尿病心肌病已日益成为严重危害人类健康的疾病，它的发生及发展是一个十分复杂的过程，近年来已逐渐成为人们关注和研究的热点。最近有研究认为，糖尿病心肌病的发生与线粒体功能的紊乱直接相关[4]。Drp1通过对线粒体分裂与融合的调控，影响线粒体的生物学功能。有研究[7]发现，在心肌细胞中，Drp1在氧化应激过程中，通过调节其表达进一步调控线粒体的分裂融合。有研究[8]发现，Drp1与心肌细胞的衰老具有明显的相关性。但Drp1在糖尿病心肌病中的作用及其机制尚不十分清楚。

本研究以db/db糖尿病小鼠为糖尿病心肌病疾病模型，首先检测了Drp1 mRNA的表达水平，结果发现db/db糖尿病小鼠心肌组织中Drp1 mRNA水平明显低于健康组，且与小鼠的周龄呈明显的负相关。为了进一步确认这一实验的准确性，采用Western Blot对Drp1的蛋白表达进行了检测，结果提示与实时定量PCR的结果相一致。免疫组织化学法发现，Drp1主要表达于胞浆，少数表达于线粒体，其排列方式与线粒体在细胞中的分布相一致。

综上认为，在糖尿病心肌病的发生及发展过程中，Drp1的表达呈明显的进行性降低，这种改变可能导致线粒体的分裂与融合的平衡被打破，使线粒体的生物学功能障碍，如ATP的生成改变，膜电位的改变以及ROS的生成改变等，从而最终导致糖尿病心肌病的发生及发展。但由于实验条件的限制，本实验仅仅是对糖尿病大鼠心肌Drp1的表达及定位进行了初步研究，并未对其进行深入研究，这也导致了本研究具有一定的局限性。因此，根据本实验的结果，我们将在后续研究中，对Drp1在糖尿病心肌病中发挥作用的具体分子机制进行更深层次的研究与探讨，以期为糖尿病心肌病的治疗提供潜在的治疗靶点。

(本文图1～3见封三)

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Expression of Drp1 in heart of diabetic mice

JingZhe*,LiuFengzhou,ChenYongqing,LiuYan,ChenChong,JingCe

(*DepartmentofCardiology,LanzhouGeneralHospital,LanzhouMilitaryRegion，Lanzhou730050，China)

Objective To observe the expression of Drp1 in the cardial muscle tissue of diabetic mice and normal mice.Methods Nine male db/db mice were randomly divided into 3 groups(db/db 6week group, db/db 12week group and db/db 18week group). Nine male normal mice were randomly divided into another 3 groups(wt 6week group, wt 12week group and wt 18week group). The expression of Drp1 was detected by real-time PCR, Western Blot and immunohistochemical. Results Compared to the normal group, the expression of Drp1 was decreased obviously in db/db mice group, and was gradually decreased with age. Conclusions The decreased expression of Drp1 maybe is one of the possible mechanisms of diabetic cardiomyopathy.

Diabetes mellitus,type 2；Myocardium；Dynamin I ；Mitochondria,heart；Mice inbred DBA

荆哲，医师，Email：35082774@qq.com

R587.1

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.06.022

2016-01-04)