生命细胞微观世界的观察和探索——TXM显微成像

王声翔，冯大敏，潘志云，王大江，韦世强

中国科学技术大学国家同步辐射实验室

生命细胞微观世界的观察和探索
——TXM显微成像

王声翔，冯大敏，潘志云，王大江，韦世强

中国科学技术大学国家同步辐射实验室

生命世界是非常神奇的，并令人震撼。自从人类进化到会出使用工具的技能，就永不停止地对生命活动进行探索和研究。随着科技的进步和文明的发展，对生命的研究也逐步从触手可及的宏观世界进入未知的微观世界。众所周知，细小到微米尺度的细胞是生命组成的基本单位，各种不同的细胞聚集在一起，再通过复杂有规律地的连接聚集成一个鲜活的生命体。生命就象像是一部独特精密的“机器”，能说会动却也有生锈的时候，有独特的思想和性格却也总会发生变化。显微成像就是能直接观察生命细胞的一种技术，它在生命科学和生命技术的进步中一直发现和见证生命的奇迹。

在人类认识生命细胞及其活动的过程中，显微镜一直是科学家观察微观生物世界的眼睛。1665年罗伯特·胡克，第一次用显微镜发现了植物细胞。自此，科学家通过对光学显微镜的改良和使用，陆续发现其他生物体细胞的存在，观察到细胞分裂现象，建立了细胞学说，也论证了整个生物界在结构上的统一性以及生命在演化上的共同起源。1931年，恩斯特·鲁斯卡和克斯·克诺尔研制了世界上第一台透射电子显微镜，并最先应用在医学和生物学领域。由于电子显微镜具有高分辨能力，可以看见细胞中的亚细胞结构以及发现病毒。在后续研究中几乎所有致病病毒的发现和认证都依赖于电子显微成像技术的运用，如1970年英国学者戴恩等在电子显微镜下观察到的乙肝病毒颗粒。这些在医学领域的探索，每一次新发现都是激动人心的，无疑对疾病的诊断和防治提供了非常重要的依据。

电子显微镜成像技术的发展，使我们可以看见细胞内部未知的世界。然而还有很多艰难的科学任务摆在我们面前，现代生物学研究对纳米分辨显微成像技术也提出了更高的要求。毫无疑问，三维成像技术的实现是显微成像技术发展的必然趋势之一。对于细胞而言，三维成像技术无论在对细胞本身定性定量的分析还是在成果说明与知识传播中都有重大的意义。如今，各类光学显微镜因为受限于衍射极限，空间分辨率低，难以看清亚细胞结构；而电子显微镜受限于电子的低穿透力，只能对先对细胞进行切片，然后每张薄片分别进行成像，拼凑出三维图像。这个过程在操作上十分困难，并且切割细胞无疑会对亚细胞结构产生不可挽回的伤害，造成信息的缺失。

透射X射线显微镜（Transmission X-ray Microscope,TXM）的出现为显微成像开辟了一条全新的路径。由于X射线的波长远小于可见光的波长，X射线成像的空间分辨能力远强于可见光成像；同时X射线具有很强的穿透能力，可以穿透完整的细胞。TXM成像时，通过旋转样品台，系统采集从0°到180°包含X射线衰减信息的二维投影图像，最后利用CT重建技术，完成对完整细胞的高分辨无损三维显微成像，这无疑对细胞生物学的研究有巨大的推动作用。

图1 细胞软X射线成像三维渲染图

其中，能量范围在284～543 eV之间的软X射线具有特殊的物理性质。此时，蛋白质等生物样品对X射线的吸收系数比水对X射线的吸收系数高一个数量级。利用这一天然的优势，软X射线可以对含水细胞进行成像研究，软X射线“水窗”成像也因此得名。2004年美国ALS同步辐射光源C.A.Larabell研究小组，使用软X射线透射显微镜首次对5微米的完整含水酵母细胞实现60纳米分辨的三维成像(图1)，获得了细胞核、液泡、囊泡等几种重要的亚细胞结构信息。为此，著名的成像专家David Attwood在2006年Nature 442,642-643上发表评论指出：“纳米分辨CT时代已经到来”。

图2 正常肝细胞和乙肝病毒感染后肝细胞X射线对照图

随着设备的改进和实验的创新，软X射线三维显微成像在细胞生物学研究中的重要性日益显著，西班牙科学家利用冷冻软X射线成像对乙肝病毒感染细胞(ACS Nano 2016,10,6597−6611)。这一生物学问题进行研究。如图2所示A、E分别是光学显微镜下的正常肝细胞和被感染的肝细胞。B、F是经过重构后的一些列软线三维成像图中的一张截面图，C、G分别是B、F区域位置的三维渲染图。实验样品不需要任何染色和化学试剂固定处理，即可清晰的观察细胞受感染前后亚细胞结构的变化。

硬X射线是指能量范围在1keV到十几keV的X射线。由于硬X射线穿透能力很强，细胞完全被穿透对X射线吸收较少，以至于采集的细胞吸收投影图像衬度较低，需要对细胞进行重金属染色来增加吸收衬度。图3是我们在硬X射线透射显微镜下对30微米尺寸大小的水稻花粉进行内部结构解析的三维分割渲染图，据此可分辨出花粉线粒体、油滴、液泡、细胞核等亚细胞结构，分别用蓝色、绿色、黄色和黑色标记。

图3 水稻花粉细胞三维渲染图

虽然软X射线和硬X射线显微成像都可以进行细胞三维成像研究，但是由于其本身的物理性质，使其各自都有较为明显的实验限制。软X射线透射显微镜可以对自然状态细胞进行成像研究，最真实的解析细胞内的秘密，但是软X射线成像的焦深比较小，难以对直径10微米以上的细胞实现完整细胞的纳米分辨三维成像。硬X射线透射显微镜具有很大的焦深，可以对绝大多数细胞成像，但是吸收衬度较低，必须对细胞进行染色等处理以提高衬度，样品处理的难度较大，且会在一定程度上破坏细胞的自然状态。迄今为止，对大多数含水细胞内部结构进行完整的纳米分辨三维成像，仍然是一个悬而未决的世界性难题。我们课题组向着绘制细胞图谱的前进方向，从X射线成像理论和实验方法学两个方向努力研究，发明了中能（2～2.5 keV）X射线泽尼克相衬显微镜。

中能（2～2.5 keV）X射线泽尼克相衬显微镜（图4）是在改变能量适用范围的前提下，在原来X射线透射显微镜中引入泽尼克相衬，主要是在物镜波带片下游放置相移环，用以提取样品的相位衬度，将相衬信号转化为光强信号。中能X射线泽尼克相衬显微成像方法将在细胞纳米分辨三维成像中发挥难以替代的作用。

首先，中能（2～2.5 keV）泽尼克相位衬度与“水窗”范围内的吸收衬度相当，对亚细胞结构有很高的分辨能力。其次，由于软X射线的穿透能力很弱，辐射剂量随细胞尺寸的增加而急剧上升。对于520 eV的软X射线，当细胞大小为5微米时，辐射剂量仅有3.16×107Gy；当细胞大小增加到20微米时，辐射剂量急剧增加到8.77×109Gy，是5微米大小细胞的277倍！在中能（2～2.5 keV）附近，辐射剂量随细胞尺寸的变化非常不敏感。尺寸为5微米的细胞，辐射剂量仅仅为8.75×106Gy。随着细胞尺寸增加到20微米，辐射剂量也只有1.1×107Gy。进一步的计算表明，即使细胞尺寸增加到40微米，辐射剂量也只有2.5×108Gy，不会对冷冻细胞样品造成明显的结构和功能损伤。这是因为2.5 keV中能X射线在20-40微米尺寸细胞中具有相当高的透过率。最后，与“水窗”软X射线显微镜相比，中能X射线泽尼克相衬显微镜的另一个优势是其扩展的焦深，在30纳米空间分辨率下，中能X射线显微镜具有15～25微米的焦深。这么大的焦深能够实现对更多种类的完整真核细胞的三维断层成像，扩大了TXM在细胞成像上的应用空间，非常适合于完整真核细胞的纳米分辨三维结构成像。获得细胞内细胞器结构的三维空间分布信息，将成为绘制细胞图谱的重要利器，对生物学研究的意义十分重大。

探索未知生命世界的脚步永不停歇，显微技术的发展如同科学巨人的手臂，不可或缺。21世纪我们的使命严峻且神圣，努力终究会获得成就，探索终究会发现奇迹。让我们共同去见证生命世界的神奇，为人类发展贡献出一份微薄之力。

图4 中能X射线泽尼克相衬显微镜

王大江，博士，中国科学技术大学国家同步辐射实验室职工。主要研究领域：X射线成像理论及应用，计算机数值模拟和图像处理等。

王大江。