烟草叶片衰老相关基因

高晓明，郭永峰

（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

烟草重要基因篇16：

烟草叶片衰老相关基因

高晓明，郭永峰*

（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

烟草（Nicotiana tabacum L.）是一种叶用经济作物，以成熟变黄的叶片为收获对象，其叶片成熟度和叶片变黄过程对烟叶产品的质量起到决定性的影响。简述了植物叶片衰老相关基因的研究概况，归纳了近年来烟草中叶片衰老调控相关基因的研究进展，总结了部分外源基因对烟草叶片衰老的影响。分析表明，研究烟草叶片衰老相关基因，对提高烟叶品质和烟草育种具有重要意义。

烟草；叶片衰老；调控基因

衰老是植物生长发育的最后一个阶段，植物衰老是植株在细胞、组织、器官或整株水平上生长衰退的过程，它由基因调控并受内外因素的影响，最终导致整株植物的死亡［1］。叶片衰老是植物衰老的主要表现形式，在正常条件下，叶片衰老主要与叶片年龄有关，是叶片的自然衰老。除此之外，叶片衰老也可以被一系列外部环境因素如光照不足、干旱、极端温度、病原体物侵染等诱导和调节。叶片衰老还与植物激素水平有密切的关系，植物内源激素如细胞分裂素、赤霉素等具有延缓衰老的作用，而乙烯、脱落酸、茉莉酸、水杨酸等则具有促进衰老的作用。叶片衰老过程中，叶绿体是第一个被分解的细胞器，因叶绿素降解导致的叶片黄化是叶片衰老的主要标志。叶绿体被分解之后，叶片的光合效率下降，其降解产物形成丰富的氮源，此时叶片的主要功能不再是进行光合作用，而是将蛋白质、脂肪、核酸等生物大分子降解形成的氮素及其它营养元素输送至茎尖、果实、幼叶等新生器官，供进一步生长发育或储存［2-5］。

1　植物叶片衰老相关基因研究概述

叶片衰老是一种程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），是细胞在一定的生理条件下，为更好的适应生存环境而发生的一种由基因控制的细胞自主有序死亡的过程［6］。程序性细胞死亡涉及一系列基因的激活、表达及调控。在此过程中，许多参与代谢及信号感知的基因，特别是转录因子以及它们的下游信号基因的表达都会发生变化。目前人们已经从拟南芥、水稻等模式植物中克隆出大量与衰老相关的基因，根据它们在叶片衰老期间表达量的变化，可分为衰老下调基因（senescence-down regulated genes，SDGs）和衰老上调基因，也叫做衰老相关基因（senescence-associated genes，SAGs）。大量与植物光合作用、生物合成相关的基因随叶片衰老表达量下调，如编码与光合过程有关的蛋白质、叶绿素a/b结合蛋白、rbcL/rbcS（2，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大/小亚基）、电子传递体（petB）、光合系统Ⅱ（psbA）的基因等［7］。叶片衰老过程伴随着大量的大分子化合物降解及降解产物的回收再利用，许多编码蛋白酶及参与营养物质分解代谢及转运蛋白的基因会随叶片衰老过程表达上调［8-9］，大部分衰老上调基因在叶片生长初期可以检测到较低水平的表达，随着叶片衰老的发展，其表达量不断升高。还有一小部分衰老上调基因，只有在叶片衰老时期才能检测到，为高度衰老特异基因，如SAG12、SAG13［10］、LSC54［9］等。此外，对拟南芥叶片衰老转录组数据分析发现，有很多转录因子家族在叶片衰老调控中起到非常重要的作用，常见的包括NAC家族转录因子、WRKY家族转录因子、C2H2锌指蛋白家族、AP2/ERFs家族、MYBs家族、homebox蛋白家族、bZIPs家族、bHLHs家族和C3H锌指蛋白家族等［11］。

目前，有关植物叶片衰老调控的分子机理的研究已经取得不少成果，大多数集中在叶片衰老相关基因的鉴定及功能分析上，也有利用基因工程手段，在延缓植物叶片衰老特性上取得了一定的成果。目前关于叶片衰老信号调控网络的研究已成为热点。

2　烟草叶片衰老相关基因研究进展

2.1烟草叶片衰老相关基因

烟草中NtCP1和NtCP2是编码半胱氨酸蛋白酶的基因，其中NtCP1是高度衰老特异表达基因，只在自然衰老的烟草叶片中表达，并且无法被不良环境条件等诱导，是烟草中一个非常好的衰老标记基因；NtCP2在成熟的烟草叶片中表达，但在衰老叶片中表达下调，其表达量受干旱和高温的影响显著，干旱或高温处理后表达下调［12］。NtCP23和MC也是编码半胱氨酸蛋白酶的基因，其中NtCP23与NtCP1的表达模式相似，呈衰老上调表达，但在叶片生长发育的初期也能检测到NtCP23的表达；MC在叶片生长发育初期的表达量最高，随叶片衰老其表达量逐步下降［13］。这些蛋白酶编码基因可能参与了叶片衰老过程中蛋白质的降解过程。

衰老叶片中的氮素一般在细胞之中通过谷氨酸合成循环转换成谷氨酰胺，以谷氨酰胺的形式通过维管束运输到幼叶及生殖器官中，以达到氮素再利用的目的［11］。NtGln1-3是烟草中一个与氮素再利用相关的基因，编码谷氨酰氨合成酶，其转录本在叶片生长发育初期较高，在成熟叶片中检测不到，但在衰老叶片中再次积累［13-14］。谷氨酸脱氢酶编码基因NtGDH1和NtGDH2也是烟草中谷氨酸合成循环相关的基因，NtGDH1和NtGDH2的表达量在成熟期和衰老早期的叶片中极低，而在衰老后期的叶片中达到最高［13］。

NtPSA1编码 26S蛋白酶体的非催化型亚基，在植物叶片和花衰老过程中的不同阶段，NtPSA1在不同组织中的表达量存在差异，其中在生长旺盛的组织中表达量较高，而在衰老的叶片和花中表达量较低［13，15］。

NtH1N1和NtH1N18是烟草中多胺信号的响应因子，在烟草叶片和花衰老过程中表达量显著上调，多胺可导致烟草的线粒体功能紊乱［16］。

烟草ndhF基因缺失突变体具有比野生型烟草晚衰30 d以上的表型，ndhF基因编码Ndh复合体，该复合体能够增加电子转运蛋白的还原程度并促进活性氧生成，导致叶绿体功能紊乱，从而促进叶片衰老［17］。

CYP82E4是烟草 P450家族基因，它编码的P450蛋白控制烟草中烟碱和去甲基烟碱的转化，研究表明CYP82E4随叶片衰老表达量显著上调［18］。

2.2其他基因对烟草叶片衰老的调控

异戊烯基转移酶（isopentenyl-transferases，ipt）是合成细胞分裂素的关键酶，1984年，Barry等［19］率先从根癌农杆菌中分离出 IPT基因，1995年，Gan等［20］将SAG12启动子与IPT基因构成的嵌合基因PSAG12-IPT成功转化入烟草，与野生型植株相比，转基因烟草叶片衰老延迟30 d，花数增加83.7%，生物量增加40.3%，种子数增加52.4%，但在株高、叶片数等方面，则与野生型植株无明显差异。此后，Wingler等［21］对 PSAG12-IPT转基因烟草进行了更加深入的研究，发现在营养缺乏的情况下，未开花的PSAG12-IPT转基因烟草的部分绿色叶片中由于电子传递链的过度还原导致光捕获和能量消耗的不平衡，从而出现坏死斑，而相同生长时期野生型烟草相同叶位的叶片虽已经变黄衰老，但未出现坏死斑。此外，Wingler等发现与发病相关的PR-1b和PR-Q基因在PSAG12-IPT转基因烟草的衰老叶片中的表达量显著高于野生型烟草衰老叶片中的表达量。Ori等［22］发现PSAG12-kn1转基因烟草与PSAG12-IPT转基因烟草有着类似的衰老表型，揭示出kn1基因除了具有抑制分化的作用之外，也对叶片衰老具有调控作用［23］。此后，Luo等［24］利用损伤诱导启动子Win3.12介导kn1的表达，PWin3.12-kn1转基因烟草同样表现出叶片晚衰的表型。BiP基因编码一个内质网分子结合蛋白，BiP过表达转基因烟草植株对干旱胁迫具有更高的耐受力［25］。CKX基因编码细胞分裂素脱氢酶，最初是在烟草组织的粗提液中检测到了具有活性的CKX［26］，拟南芥AtCKX2基因过表达烟草植株的抗氧化能力显著增强，即使在细胞分裂素水平显著降低的情况下，该转基因烟草也表现出了明显的晚衰表型［27］。

3　前景与展望

烟草是一种叶用经济作物，收获对象是成熟变黄的叶片。叶片成熟落黄本身或烟叶成熟度通过影响采收后的烘烤调制过程对烟叶产品外观质量、物理特性、化学成分、烟气特征和卷烟安全性等主要质量因素的形成起到决定性的影响。比如，烟叶成熟过程伴随着叶绿素的降解，叶绿素降解形成烟草致香物质的前体物是形成不同特色烟叶的物质基础［28］。作为一个受遗传控制的发育过程，叶片衰老的进程可以通过基因突变、遗传转化及分子标记辅助育种等手段进行调控。在对控制烟叶成熟落黄及相关烟叶质量因素形成过程的分子机制进行系统研究的基础上，通过鉴定、克隆和调控烟草叶片成熟衰老的关键调控基因及其分子标记，最终可以实现对烟叶成熟落黄过程进行人为干预，这也是研究特色烟叶形成的理论基础，对烟草育种和烟叶生产具有重要的实际意义。目前国内外植物叶片衰老的研究主要以模式植物拟南芥以及水稻、小麦、棉花等经济作物为对象，而对烟草叶片衰老的研究非常少。深入研究烟草叶片衰老的调控机理具有重要的理论意义和实践价值。

［1］ Lim P O， Kim H J， Nam H G. Leaf senescence［J］. Annu Rev Plant Biol， 2007， 58: 115-136.

［2］ Izumi M， Hidema J， Makino A， et al. Autophagy contributes to nighttime energy availability for growth in Arabidopsis［J］. Plant Physiol， 2013， 161（4）: 1682-1693.

［3］ Robinson W D， Carson I， Ying S， et al. Eliminating the purple acid phosphatase AtPAP26 in Arabidopsis thaliana delays leaf senescence and impairs phosphorus remobilization［J］. New Phytol， 2012， 196（4）: 1024-1029.

［4］ Tegeder M. Transporters involved in source to sink partitioning of amino acids and ureides: opportunities for crop improvement［J］. J Exp Bot， 2014， 65（7）: 1865-1878.

［5］ Gan S， Amasino R M. Making sense of senescence （Molecular genetic regulation and manipulation of leaf senescence）［J］. Plant Physiol， 1997， 113（2）: 313-319.

［6］ 杨征，蔡陈崚，宋运淳．植物细胞凋亡研究进展［J］．生物化学与生物物理进展，1999，26（5）；439-443.

［7］ 王建勇，姚晓华，张志斌. 植物叶片衰老机理与调控研究进展［J］．安徽农业科学，2011，39（31）：19036-19038，19058.

［8］ ThomasH，StoddartJL.Leaf senescence［J］. Annul Rev Plant Physiol， 1982， 31: 83-111.

［9］ Buchanan-Wollaston V. Isolation of cDNA clones for genes that are expressed during leaf senescence in Brassica napus. Identification of a gene encoding a senescence-specific metallothionein-like protein［J］. Plant Physiol， 1994， 105（3）: 839-846.

［10］ Gan S. Molecular characterization and genetic manipulation of plant senescence［D］. University of Wisconsin-Madison， Madison， WI， USA， 1995.

［11］ Guo Y， Cai Z， Gan S. Transcriptome of Arabidopsis leaf senescence［J］. Plant Cell Environ， 2004， 27（5）: 521-549.

［12］ Beyene G， Foyer C H， Kunert K J. Two new cysteine proteinases with specific expression patterns in mature andsenescent tobacco （Nicotiana tabacum L.） leaves［J］. J Exp Bot， 2006， 57（6）: 1431-1443.

［13］ Uzelac B， Janošević D， Simonović A， et al. Characterization of natural leaf senescence in tobacco （Nicotiana tabacum） plants grown in vitro［J］. Protoplasma，2016， 253（2）: 259-275.

［14］ Brugière N， Dubois F， Masclaux C， et al. Immunolocalization of glutamine synthetase in senescing tobacco （Nicotiana tabacum L.） leaves suggests that ammonia assimilation is progressively shifted to the mesophyll cytosol［J］. Planta， 2000， 211（4）: 519-527.

［15］ Bahrami A R， Gray J E. Expression of a proteasome α-type subunit gene during tobacco development and senescence［J］. Plant Mol Biol， 1999， 39（2）: 325-333.

［16］ Takahashi Y， Berberich T， Yamashita K， et al. Identification of tobacco HIN1， and two closely related genes as spermine-responsive genes and their differential expression during the Tobacco mosaic virus -induced hypersensitive response and during leaf- and flowersenescence［J］. Plant Mol Biol， 2004， 54（4）: 613-622.

［17］ Zapata J M， Guéra A， Esteban-Carrasco A， et al. Chloroplasts regulate leaf senescence: delayed senescence in transgenic ndhF-defective tobacco［J］. Cell Death Differ，2005， 12（10）: 1277-1284.

［18］ Chakrabarti M， Bowen S W， Coleman N P， et al. CYP82E4-mediated nicotine to nornicotine conversion in tobacco is regulated by a senescence-specific signaling pathway［J］. Plant Mol Biol， 2008， 66（4）: 415-427.

［19］ Barry G F， Rogers S G， Fraley R T， et al. Identification of a cloned cytokinin biosynthetic gene［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1984， 81（15）: 4776-4780.

［20］ Gan S S， Amasino R M. Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin［J］. Science， 1995，270（5244）: 1986-1988.

［21］ Wingler A， Brownhill E， Pourtau N. Mechanisms of the light-dependent induction of cell death in tobacco plants with delayed senescence［J］. J Exp Bot， 2005， 56（421）: 2897-2905.

［22］ Kerstetter R A， Laudencia-Chingcuanco D， Smith L G， et al. Loss of function mutations in the maize homeobox gene，knotted1， are defective in shoot meristem maintenance［J］. Development， 1997， 124（16）: 3045- 3054.

［23］ Ori N， Juarez M T， Jackson D， et al. Leaf senescence is delayed in tobacco plants expressing the maize homeobox gene knotted1 under the control of a senescence-activated promoter［J］. Plant Cell， 1999， 11（6）: 1073-1080.

［24］ Luo K， Deng W， Xiao Y， et al. Leaf senescence is delayed in tobacco plants expressing the maize knotted1 gene under the control of a wound-inducible promoter［J］. Plant Cell Rep， 2006， 25（11）: 1246-1254.

［25］ Alvim F C， Carolino S M， Cascardo J C， et al. Enhanced accumulation of BiP in transgenic plants confers tolerance to water stress［J］. Plant Physiol， 2001， 126（3）: 1042-1054.

［26］ Paces V， Werstiuk E， Hall R H. Conversion of N6-（Δ2-isopentenyl） adenosine to adenosine by enzyme activity in tobacco tissue［J］. Plant Physiol， 1971， 48: 775-778.

［27］ Mýtinová Z， Motyka V， Haisel D， et al. Antioxidant enzymatic protection during tobacco leaf ageing is affected by cytokinin depletion［J］. Plant Growth Regul，2011， 65（1）: 23-34.

［28］ 梁洪波，李念胜，元建，等. 烤烟烟叶颜色与内在品质的关系［J］. 中国烟草科学，2002，23（1）：9-11.

Leaf Senescence Related Genes in Tobacco

GAO Xiaoming， GUO Yongfeng*
（Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Tobacco （Nicotiana tabacum L.） is an economic crop in which mature yellow leaves are harvested. Leaf maturity and the ripening process have a decisive influence on the quality of tobacco products. In this article we briefly introduce the research progress of plant leaf senescence related genes. We also summarize the research progress in genes related to tobacco leaf senescence and the effects of exogenous genes on the senescence of tobacco. It is of great importance to study tobacco leaf senescence process and related genes in order to improve the quality of tobacco.

tobacco； leaf senescence； regulating genes

S572

1007-5119（2016）04-0097-04

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.017

农业部948项目（2013-Z4）；中国农业科学院基本科研业务费增量重点项目（2013ZL024）

高晓明（1984-），助理研究员，主要从事烟草叶片衰老分子调控研究。E-mail：gaoxiaoming@caas.cn。*通信作者，E-mail：guoyongfeng@caas.cn

2016-07-26

2016-08-12