基于指纹图谱技术的银杏叶黄酮类成分分析研究进展

2016-02-01闫玉娇吴佩颖

中成药 2016年5期

关键词：银杏叶

闫玉娇，吴佩颖

（上海中医药大学，上海201203）

基于指纹图谱技术的银杏叶黄酮类成分分析研究进展

闫玉娇，吴佩颖

（上海中医药大学，上海201203）

摘要：以银杏叶为原料的制剂被广泛应用于治疗心脑血管疾病，其主要有效物质为黄酮类和内酯类成分。目前，指纹图谱技术应用于中药质量的分析评价已得到广泛认可。本文通过查阅文献，对基于该技术的银杏叶黄酮类成分研究进展进行归纳综述。

关键词：银杏叶；黄酮类成分；指纹图谱技术

银杏GinKgo biloba L.为银杏科植物，现仅存1属1种，是新生代第四纪冰川时期孑遗植物，素有“活化石”之称［1］。银杏叶（GinKgo Folium）是其干燥叶，作为我国传统中药，其药用功效在我国中医论著《滇南本草》、《本草纲目》、《本草品汇精要》中均有记载［2］。继《中国药典》1977年版收载了其质量标准后，2005年版增加了银杏叶提取物和银杏叶片质量标准，2010年版新增了银杏叶胶囊和银杏叶滴丸质量标准，2015年版则未作增加。此外，《欧洲药典》规定了银杏叶和银杏叶提取物的质量标准，《美国药典》将银杏叶及其制剂作为食品补充剂收录在册。银杏叶及其制剂是全球植物药制剂的重要品种之一，在治疗心脑血管疾病方面发挥着重要作用［3］。

银杏叶中的主要成分有黄酮、萜内酯、有机酸、氨基酸、聚戊烯醇、糖、矿物质、色素、生物碱等，其中有效成分为黄酮和萜内酯。本文主要对基于指纹图谱技术的银杏叶黄酮类成分研究进展进行归纳综述。

1 银杏叶黄酮类成分及其药理作用

银杏叶中的黄酮类化合物多以苷的形式存在，其苷元主要包括黄酮、黄酮醇、双黄酮、黄烷醇、异黄酮、二氢黄酮几类［4］。

1.1 黄酮（醇）苷类主要以槲皮素、山柰素、异鼠李素为苷元，以葡萄糖基、鼠李糖基、香豆酰基为衍生基团连接而成（如芦丁）。此外，还有少量以杨梅素、落叶松黄酮、丁香亭、芹黄素为苷元苷类［5］。

1.2 黄酮醇类即C环3位被-OH取代，主要有槲皮素、山柰素、异鼠李素、杨梅素、落叶松黄酮、丁香亭、柽柳黄素。

1.3 黄酮类即C环3位未被-OH取代，而且C2-C3键为不饱和结构，主要有芹黄素、木犀草素、金合欢素。

1.4 异黄酮类即B环与C环3位相连的结构，主要有染料木素。

1.5 双黄酮类即由二分子黄酮衍生物聚合而成的二聚物，多由二分子芹菜素（或其甲醚衍生物）构成，双黄酮是裸子植物的特征性成分，主要有穗花杉双黄酮、去甲银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金钱松双黄酮、5' -甲氧基去甲银杏双黄酮［6］。

1.6 二氢黄酮类即C环3位未被-OH取代，而且C2-C3键为饱和结构，此类化合物较少，现已报导的有aromadendrin和5，7，4'-trihydroxy-flavone［7］。

1.7 黄烷醇类即C环3位被-OH取代，而且C2-C3键为饱和结构，主要有儿茶素、表儿茶素、没食子酸儿茶素和表没食子酸儿茶素。此外，还有以分子聚合形式生成的原花青素类，含有量较高，但目前只分得单体原花青定和原翠雀素［8］。

1.8 药理作用银杏叶黄酮及其苷类成分具有很强的抗自由基和抗氧化作用［9］，可延缓疲劳发生［10］，而且还有抗癌［11］、抗菌［12］、抗病毒、抗炎、抗过敏、抗血栓［13］和抗糖尿病并发症等药理活性，可预防心脑血管疾病（如动脉粥样硬化［14］），提升记忆力，预防老年痴呆症。临床上多用于动脉硬化及高血压所致的冠状动脉供血不全、心绞痛、心肌梗塞、脑栓塞、脑血管痉挛等心脑血管疾病的治疗。此外，银杏双黄酮可通过抗磷酸二酯酶活性而达到有效减肥的目的［15］。

2 基于指纹图谱技术的银杏叶黄酮类成分分析研究

银杏叶中黄酮类成分复杂，各成分含有量和极性差异大，故其质量控制具有一定困难。为克服现有质量控制模式的局限性，采用指纹图谱技术可有效解决银杏叶中黄酮类成分复杂、难以分析的问题，已成为研究的热点。

2.1 中药指纹图谱研究与应用的基本状况目前，指纹图谱作为中药质量控制方法之一，已被国内外药学领域所认可。国家食品药品监督管理局（CFDA）将中药材及中药注射剂的指纹图谱定义为“中药材或中药注射剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标识该中药材或该中药注射剂特性的共有峰的图谱成为指纹图谱［16］”；美国食品与药品管理局（FDA）允许草药保健品申报指纹图谱；英国草药典、印度草药典及加拿大药用级芳香植物学会、德国药用植物学会接受指纹图谱；欧盟、欧共体也将色谱指纹图谱监控技术用于植物药的质量控制［17］；世界卫生组织（WHO）在1996年草药评价指导原则也认为，可提供色谱指纹图谱来证明产品质量一致；日本汉方药主要生产企业自1980年以来，已在企业内部采用HPLC指纹图谱控制质量。

我国对中药指纹图谱的研究最早可追溯到20世纪60年代，其包括中药材、提取物、中药饮片和中成药等，根据分析手段不同，可分为中药生物指纹图谱和中药化学指纹图谱。其中，前者主要有DNA指纹图谱，Mei等［18］以ISSR和RADD分析方法为基础，建立银杏DNA指纹图谱，生成银杏遗传特征地图，为该植物的遗传特征描述提供方法；后者主要有色谱指纹图谱（薄层色谱、高效液相、气相液相、高速逆流色谱、高效毛细管电泳指纹图谱）、光谱指纹图谱（紫外光谱，红外光谱，核磁共振氢谱、X-射线衍射指纹图谱［19］）以及采用多种现代分析仪器联用所得到的多维多息特征谱（HPLC-MS、HPLC-MS-MS、GC-MS、CE-MS［20］）等。目前针对银杏叶，大多采用色谱指纹图谱。

2.2 银杏叶黄酮类成分的分析研究

2.2.1 高效液相（HPLC）指纹图谱 HPLC具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、选择性高的特点，而且随着检测器种类（如UV、DAD、ELSD）的增加，其适用范围越来越广，已成为应用最广泛的检测方法。

李奕雅［21］以银杏叶对照提取物为参照，制定银杏干叶指纹图谱，获得共有峰11个。吴静等［22］以水-乙腈-异丙醇-柠檬酸为流动相，建立银杏叶提取物指纹图谱，获得共有峰14个。牟玲丽［23］以芦丁为参照物，制定了银杏提取物对照图谱，标定共有峰16个，为进一步分析血清图谱中药源性来源奠定了基础。杨兴变等［24］在360 nm波长下分析银杏叶和针剂用银杏叶提取物，得到共有峰18个。丁银花等［25］以氯仿回流提取除杂，甲醇提取有效成分，制定银杏叶指纹图谱，得到共有峰28个。赵一懿等［26］以银杏叶对照药材为参照，制定银杏叶药材指纹图谱，获得共有峰24个，并同时兼顾11个黄酮类成分的定量测定。Xie等［27］在254 nm和360 nm波长下建立银杏叶提取物指纹图谱，通过对19批样品相似度的比较和聚类分析，发现指纹图谱可用于揭示中药掺假掺杂现象。陈伟等［28］分别制定了银杏达莫注射液原料、中间体和成分的指纹图谱，并指认其中7个主要色谱峰，用于生产过程的质量控制。孙冬梅［29］以芦丁和异鼠李素为参照物，制定银杏叶药材指纹图谱，获得共有峰30个。Ji等［30］在350 nm检测波长下建立银杏叶提取物指纹图谱，得到共有峰30个，同时阐明建立指纹图谱的相关研究思路。李利锋等［31］利用2.7 μm粒径填料C18色谱柱来优化色谱条件，建立银杏叶片HPLC定量指纹图谱，得到共有峰48个，同时进行4个成分的含有量测定。

此外，蒸发光散射检测器（ELSD）作为通用型检测器，可补充没有紫外吸收的物质。崔红芳［32］制定了银杏药材HPLC-ELSD指纹图谱，以白果内酯为参照物，获得共有峰18个。除了单一检测器的应用外，多种检测器联用模式也得到了发展，可同时兼顾黄酮类和内酯类成分的检测。陈凡［33］利用HPLC-DAD-ELSD联用技术制定了银杏叶提取物多维指纹图谱，其中DAD检测器取360 nm下图谱，获得共有峰19个；ELSD检测器获得共有峰14个。Van Nederkassel等［34］利用HPLC-UV-ELSD技术建立银杏提取物指纹图谱，其中UV检测器取267 nm下图谱，获得色谱峰77个，而ELSD检测器获得色谱峰73个。

2.2.2 液质联用（HPLC-MS）指纹图谱由于中药的复杂性，单一分析方法难以全面提供其所需信息，而联用技术不仅可使复杂成分得到有效分析，还可提供化学成分的结构信息，是分析复杂成分的有效手段。

马欣［35］运用API-ES离子源负离子检测银杏提取物的乙醇提取液，成功得到质谱总离子流图51个共有峰，比HPLC色谱图（33个）更全面。孙冬梅等［36］以负离子模式建立银杏磷脂软胶囊中12种黄酮类成分的快速筛查方法，为保健食品质量控制提供基础。梁文琳［37］制定银杏叶片甲醇溶液指纹图谱，HPLC色谱图得到共有峰31个，同时运用Q-TOF-MS技术鉴定出31个共有峰均为黄酮类成分。Liu等［38］以UHPLC-QQQ-MS技术对银杏叶片黄酮苷、黄酮苷元和内酯类成分共18个化合物同时进行定量测定。Zhou等［39］利用UAE-UHPLC-TQ/MS2技术建立银杏叶26种成分的同时定性定量方法，实现黄酮、内酯、酚酸和苯丙素类4种类型化合物的同时检测。Guo等［40］将二维UHPLC （LC×LC）技术用于银杏叶提取物分析，并结合DPPH法筛选具有清除自由基活性的成分，结果在鉴定出的61种化合物中得到25种活性成分；Ding等［41］以capillary HPLC/ MS方法建立银杏叶指纹图谱，定性分析77个化合物，进一步阐明银杏叶活性的物质基础。

2.2.3 加压毛细管电色谱法/毛细管电泳（pCEC/CE）指纹图谱毛细管电泳（CE）具有高效、抗污染能力强等特点，而毛细管电色谱（CEC）是液相色谱（LC）和毛细管电泳的结合，既解决了后者选择性差的问题，又提高了前者的分离效率。加压毛细管电色谱（pCEC）是将高压泵和进样阀引入到毛细管电色谱中，进一步拓展其优势［42］。吴孔弦［19］利用TriSepTM-2100加压毛细管电色谱仪分析了银杏叶药材加压毛细管电色谱指纹图谱，得到29个共有峰。马欣［35］利用毛细管电泳技术分析了银杏叶提取物指纹图谱，得到13个共有峰。

2.2.4 薄层色谱（TLC）指纹图谱薄层色谱具有分析速度快、操作简便、经济廉价、结果直观形象、应用范围广等特点，但由于分辨率较低，在复杂成分的指纹图谱应用中受到局限。杨锦瑜等［43］利用薄层色谱紫外分析仪制定了银杏叶薄层指纹图谱，以芦丁、槲皮素为参照物，获得黄酮斑点12个。杨天鸣等［44］对7个不同厂家的银杏叶片进行分析，获得X-射线衍射Fourier指纹图谱。孙国祥等［45］利用傅里叶红外分光光度仪制定了银杏叶片红外指纹图谱。孔祥鹏等［46］利用傅里叶变换红外光谱仪制定了银杏叶化学组分群动态指纹图谱。张小利等［47］对不同工艺制备银杏叶提取物进行谱图特征分析。刘建庄［15］利用核磁共振技术，对用以银杏叶提取物为原料经酸水解后的产物进行了一系列指纹图谱分析。牟新利等［48］用三维荧光来研究银杏叶中药指纹图谱。

3 小结

基于指纹图谱技术对银杏叶黄酮类成分的研究作为质量评价的有效手段时，不仅可真实反映药材、中间体、中成药的内在质量，还可通过三者相关性分析来达到追溯作用，为合理采收提供依据［49］，也为原料药产地固定提供理论支持［25］。此外，指纹图谱技术可用于控制整个产业链实时监控［24］、对照物质标定［50］，也可用于联合用药后的安全性考察。何正有等［51］建立指纹图谱来考察银杏达莫注射液与7个药物的配伍稳定性，为临床用药安全提供科学依据。

随着分析仪器水平的不断提高，高效液相指纹图谱正逐渐替代薄层色谱指纹图谱，成为主要分析手段。质谱的应用也使指纹图谱越来越要求尽可能阐明色谱峰成分，由“宏观”向“微观”延伸，不仅要求整体的“相似度”，而且可精确分辨“非相似”部分的成分。因此，获得更全面的色谱信息和更精确的成分鉴定是使指纹图谱进一步完善的重要部分。

当然，指纹图谱技术仍存在如下问题：（1）中药指纹图谱质量控制方法若以标准指纹图谱为参考，则由于实验条件一致性而无法确定是否可能影响重复性；若以对照品为参考，则存在品种覆盖不全面等问题；（2）银杏叶是天然产物，所含黄酮类成分的内在不稳定性及外在条件差异，使其稳定性难以掌控；（3）指纹图谱研究仅专注于共有峰，着力于模式识别和相似性判断，而忽略指纹峰的鉴定以及特定提取部位的生物效应表征，容易在样品处理过程中丢失相关药效的成分，使标准图谱缺乏可靠性［52］；（4）指纹图谱研究应进行更深层次的研究，探讨化学成分指纹图谱-药效指纹图谱-药物代谢指纹图谱的关系，建立三维模式［53］。只有更加深入地开展研究，更好地解决指纹图谱技术对银杏叶黄酮类成分研究中存在的问题，才能在生产实际中得到推广应用，有效保证银杏叶原料、提取物、制剂的质量，真正实现药品安全、有效、稳定的目标。

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