顺铂诱导食管癌EC9706耐药细胞中Bcl-2的表达

银　瑞　董新伟　王　铮

(南阳市中心医院 胸外科，河南　南阳　473009)



顺铂诱导食管癌EC9706耐药细胞中Bcl-2的表达

银瑞董新伟王铮

(南阳市中心医院 胸外科，河南南阳473009)

〔摘要〕目的探讨凋亡抑制蛋白Bcl-2在顺铂(DDP)诱导食管癌EC9706耐药细胞中的表达。方法建立EC9706/DDP细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率，Western印迹检测DDP处理后EC9706细胞及EC9706/DDP细胞Bcl-2蛋白表达，RT-PCR、荧光定量PCR检测Bcl-2 mRNA水平。结果EC9706/DDP细胞对DDP诱导的凋亡不敏感，Western印迹检测到EC9706/DDP细胞中Bcl-2表达上调，与EC9706细胞相比具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR、荧光定量PCR检测到EC9706/DDP细胞中Bcl-2 mRNA水平上调，与EC9706细胞相比具有统计学意义(P<0.05)。结论Bcl-2表达上调可能为食管癌EC9706细胞对DDP耐药的重要机制。

〔关键词〕Bcl-2；食管癌；顺铂；耐药

第一作者：银瑞(1973-)，男，硕士，副主任医师，主要从事胸外科疾病的临床诊治和基础研究。

食管癌的治疗方案中，化疗一直占有重要地位，但肿瘤细胞对化疗药物的原发或继发性耐药，以及肿瘤细胞的凋亡缺陷或受阻常导致化疗的失败〔1〕。已知Bcl-2家族在调节细胞程序性死亡及提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性方面发挥着重要作用，其重要成员Bcl-2基因在包括食管癌在内的多种肿瘤组织中可过度表达，并不同程度地抑制化疗药物介导的细胞凋亡〔2〕。本研究观察顺铂(DDP)诱导食管癌细胞株EC9706耐药细胞中Bcl-2的表达，旨在探讨EC9706细胞对DDP耐药的机制。

1材料与方法

1.1材料人EC9706细胞由河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室保存；RPMI-1640培养基、购自美国Gibco公司；小鼠抗人Bcl-2单抗购自CST公司；小鼠抗人β-actin单抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司；β-actin 及Bcl-2 引物由上海生物公司合成；四甲基偶氮唑盐(MTT)购于Sigma公司；DDP购于山东齐鲁制药有限公司。

1.2细胞培养EC9706细胞在含有10%小牛血清、1%双抗的RPMI-1640培养基中于37℃、5%CO2饱和湿度下进行培养。将DDP溶于乙二胺四乙酸(DMSO)配成1 mmol/L的储存液，于-20℃下保存。细胞传代后24 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，对照组更换新鲜培养液，实验组加入DDP，收集备用。

1.3EC9706/DDP耐药细胞的建立选取对数生长期的EC9706细胞，DDP作用浓度从0.03 μmol/L开始，48 h后弃去培养液并加入新鲜培养液继续培养，观察无明显死亡细胞后选择对数生长期细胞进行传代，增加25%~50% DDP药物浓度，反复传代，使之稳定，直至该细胞株能在0.3 μmol/L的DDP浓度下长期生存。

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡率将处于对数生长期的EC9706与EC9706/DDP细胞接种于24孔板培养过夜，选择不同剂量的DDP作用于EC9706、EC9706/DDP细胞。收集24孔板中上清液，各孔用PBS洗涤1遍，1 200 r/min离心10 min，弃去上清液，每孔再加入750 μl碘化丙啶(PI)染液，37℃避光，作用20 min后收集，4℃避光过夜，于流式仪检测，用WinMDI 2.9软件分析，有G1期DNA含量的细胞比例即细胞凋亡率。

1.5MTT法检测细胞存活率将处于对数生长期的EC9706、EC9706/DDP细胞分别接种于96孔板，于37℃、5% CO2温箱培养3 d，加入不同浓度的DDP，每孔加MTT溶液20 μl，孵育4 h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μl DMSO并振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，测定各孔吸光值，记录结果。

1.6Western印迹法检测Bcl-2蛋白表达收集细胞并使用预冷PBS洗涤2遍，加入裂解液，冰上孵育30 min，4℃、12 000 r/min离心30 min，吸取上清液。用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，将已定量好的细胞总蛋白与缓冲液等量混合，沸水煮3~5 min备用。20 μg总蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，移至硝酸纤维素膜，转膜后用5%脱脂牛奶/Tris盐酸缓冲液(TBST)封闭2 h，加入一抗β-actin、小鼠抗人Bcl-2，按1∶1 000稀释，室温孵育2 h，TBST洗3次，每次15 min，加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(1∶10 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗3次，每次15 min。用电化学发光法(ECL)试剂盒进行显影曝光。

1.7RT-PCR琼脂糖凝胶电泳检测Bcl-2 mRNA表达TRIzol法提取EC9706/DDP细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明，将RNA逆转录成cDNA。再以逆转录出的cDNA为模板建立反应体系。β-actin引物序列：正义：5′-GACCTGACTGACTACCTCATGAAGAT-3′，反义：5′-GTCACACTTCATGA-TGGAGTTGAAGG-3′。Bcl-2引物序列：正义：5′-TTCGCCGAGTCCAGGC-3′，反义：5′-TCACTTGTG-GCCCAGATAGC-3′。95℃预变性5 min，95℃变性30s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，共40个循环，最后72℃延伸10 min，产物在琼脂糖凝胶进行电泳。

1.8实时荧光定量PCR检测Bcl-2基因在细胞内mRNA的表达Bcl-2检测引物如上述，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为内参，正义：5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′，反义：5′-ACGGTGCCATGGAAT-TTGCC-3′，扩增长度 196 bp，反应体系为10 μl，含上、下游引物各1 μl，模板DNA 1 μl，双蒸水6 μl，荧光定量PCR反应混合液10 μl。应用ABI7500 Fast型实时荧光定量PCR仪进行PCR反应，并设定运行参数：95℃ 3 min预变性，然后95℃ 5 s变性，60℃ 25 s退火与延伸，40个循环，并使用软件分析相对表达量(RQ)。

1.9统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1EC9706/DDP与EC9706细胞形态比较显微镜观察EC9706细胞呈圆形，大小均一，形态规则。而EC9706/DDP大小不均一，形态不规则，可见瘤巨细胞和凹陷。

2.2DDP诱导EC9706/DDP与EC9706凋亡率比较用不同浓度(0.2、0.3、0.4 μmol/L)DDP诱导EC9706/DDP与EC9706细胞48 h，两组细胞的凋亡率分别为(2.08±0.99)%、(7.52±0.86)%、(9.25±1.02)%和(4.56±0.56)%、(25.35±1.22)%、(40.21±0.93)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3DDP对EC9706/DDP与EC9706的增殖抑制作用比较分别采用不同浓度的DDP(0.2、0.3、0.4 μmol/L)作用于EC9706/DDP与EC9706细胞48 h后，MTT法检测细胞存活率分别为(95.23±2.32)%、(92.03±2.88)%、(88.23±2.96)%和(89.53±0.88)%、(82.13±1.96)%、(78.52±3.11)%，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4DDP作用于EC9706/DDP和EC9706后对Bcl-2蛋白表达的影响Bcl-2在EC9706细胞株中表达下调，与0 h蛋白表达量比较，在6 h后开始降低(P<0.05)；同时Bcl-2在EC9706/DDP细胞株中表达明显上调，与0 h蛋白表达量比较，在6 h后开始升高(P<0.05)。两组间比较差异显著(P<0.05)。Bcl-2在两组细胞中的表达差异说明抗凋亡蛋白Bcl-2变化可能在DDP耐药机制中起重要作用。

2.5DDP诱导耐药细胞株EC9706/DDP中Bcl-2 mRNA表达水平变化在明确了DDP作用EC9706/DDP后Bcl-2蛋白水平是上调的，进一步探讨mRNA水平的变化。采用特异性引物通过RT-PCR反应检测Bcl-2 mRNA水平也是上调的，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明Bcl-2的变化受到转录水平上的调控。通过实时荧光定量PCR计算相对定量结果显示，Bcl-2 mRNA在EC9706细胞、EC9706/DDP细胞中RQ分别为0.032±0.002、0.481±0.001，EC9706/DDP细胞mRNA的表达水平明显高于EC9706细胞(P<0.05)。

3讨论

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，指细胞在一定条件下通过启动内部机制，经过一连串的细胞变性，最终发生死亡的过程〔2〕。目前对Bcl-2、p53、bax等凋亡调控基因研究较多，通常认为bax和p53诱导凋亡，而Bcl-2则抑制凋亡〔3〕。Bcl-2基因是1984年Tsujimoto等〔3〕从与滤泡性淋巴细胞瘤相关的染色体易位的断裂点克隆到的一种癌基因，Bcl-2蛋白过度表达，可抑制细胞的凋亡并延长细胞寿命，参与肿瘤发生，Bcl-2的这一作用通常认为是通过封闭细胞核转运、抑制细胞内钙离子浓度增高等途径实现的。Bcl-2作为细胞凋亡的强抑制基因，在许多肿瘤细胞中高表达，临床研究发现，Bcl-2基因的表达与淋巴结转移、血管损害、p53异常表达和细胞凋亡的发生呈负相关，在中、晚期癌症中Bcl-2的表达更强〔4〕。

化疗药物耐药是影响化疗效果的重要因素，凋亡抑制基因Bcl-2能抑制化疗药物介导的细胞凋亡，被视为一种新的耐药相关基因〔5〕。研究发现，在Bcl-2过度表达的细胞，药物仍能进入细胞内，诱导细胞损伤，但这种损伤不能有效地转换成凋亡信号，从而使肿瘤细胞的生理性凋亡受抑制，增加了肿瘤细胞的生存时间，以致在化疗期间表达Bcl-2的肿瘤细胞能以较快的速率重新生长，造成细胞过多堆积，从而参与了耐药的发生〔6〕。

本实验提示Bcl-2作为抗凋亡Bcl-2家族中的重要一员，其在DDP诱导的EC9706凋亡中起抑制作用。因此，Bcl-2的表达上调可能是EC9706细胞对DDP耐药的重要机制，Bcl-2可作为食管癌基因治疗的靶点，通过各种途径抑制Bcl-2基因的表达从而促进肿瘤细胞凋亡，减少耐药将为本课题后续研究重点。

4参考文献

1Hong J，Peng DF，Chen Z，etal.ABL regulation by AXL promotes cisplatin resistance in esophageal cancer〔J〕.Cancer Res，2013；73(1)：331-40.

2Martinou JC，Youle RJ.Mitochondria in apoptosis：Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics〔J〕.Dev Cell，2011；21(1)：92-101.

3Tsujimoto Y，Finger LR，Yunis J，etal.Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t (14；18) chromosome translocation〔J〕.Science，1984；226(4678)：1097-9.

4Ola MS，Nawaz M，Ahsan H.Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis〔J〕.Mol Cell Biochem，2011；351(1-2)：41-58.

5Kelly PN，Strasser A.The role of Bcl-2 and its pro-survival relatives in tumourigenesis and cancer therapy〔J〕.Cell Death Differ，2011；18(9)：1414-24.

6Llambi F，Green DR.Apoptosis and oncogenesis：give and take in the BCL-2 family〔J〕.Curr Opin Gene Dev，2011；21(1)：12-20.

〔2015-03-25修回〕

(编辑袁左鸣)

〔中图分类号〕R735.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0562-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.020