皮肤致敏试验替代方法的研究进展

陈 宁，王 平，冼静雯，谢天柱，秦美容，李俊鹏，鲁 艺，王晓炜，石海宁，龙绍蓉

(1.深圳市药品检验研究院，深圳 518057;2.哈佛大学医学院麻省总医院，波士顿 02114; 3.郑州大学基础医学院，郑州 450000)

“3R”

皮肤致敏试验替代方法的研究进展

陈 宁1，王 平1，冼静雯1，谢天柱1，秦美容1，李俊鹏1，鲁 艺1，王晓炜1，石海宁2，龙绍蓉3

(1.深圳市药品检验研究院，深圳 518057;2.哈佛大学医学院麻省总医院，波士顿 02114; 3.郑州大学基础医学院，郑州 450000)

皮肤致敏(过敏性接触性皮炎)是皮肤接触某些小分子化合物而引起的迟发性超敏反应。经典的检测化学物接触致敏性的方法是通过动物试验来检测，鉴于欧盟于2013年颁布全面禁止化妆品动物试验的规定，替代试验将来是化学品/化妆品致敏研究的主要趋势，本文综合近年的国内外文献，对现行的通过OECD认证的和正在开展研究的皮肤致敏替代试验，如LLNA、DPRA、KeratinoSensTM、h-CLAT试验等进行综合论述和评估，为未来体外替代试验能够客观、公正的对致敏结果评估提供参考。

皮肤致敏;过敏性接触性皮炎;体外替代

皮肤致敏(skin sensitization)(过敏性接触性皮炎allergic contact dermatitis，ACD)是皮肤对外源物质产生的免疫原性皮肤反应，对于人类这种反应以瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征。动物反应可能为皮肤红斑和水肿［1］。经典的检测化学物接触致敏性的方法是豚鼠最大值试验(guinea pig maximization test，GPMT)及局部封闭涂皮试验(Buehler test，BT)［2］，但这些试验需要大量的动物。目前国际上对动物福利的呼声越来越高，欧盟现行化妆品法规1223/2009/EC于2009年颁布，2013年7月全面生效，取代 1976年颁布的 76/768/EC指令，成为欧洲化妆品行业的统一法规，新法规继续保留了禁止动物试验的规定［3］，加强替代方法的研发投入与支持，鼓励替代方法的运用，将成为未来药品化妆品安全性评价的主要趋势。

1 皮肤致敏体内替代试验

1.1 小鼠局部淋巴结试验 (local lymph node assay，LLNA)

LLNA是用小鼠代替豚鼠对化学物致敏性进行检测，它是最早通过认证的皮肤致敏替代方法，2002年世 界 经 合 组 织 (Organization forEconomic Cooperation and Development，OECD)将其作为化学物致敏性检测的标准方法，即 OECD TG-429［4］。相比传统的豚鼠法LLNA优势更加明显，在于它周期短，减少了动物的使用量，优化了受试物给药方法，减少了动物的痛苦，只需要建立诱导阶段，灵敏度高，能辨别低分子量的致敏化学物［5］。

由于LLNA不能很好地区分致敏物和刺激物，在某些皮肤致敏物质试验中会出现假阴性或者假阳性结果，如氯化镍、硫酸镍、十二烷基硫酸钠等，且需使用放射性核素，易造成环境污染［6］。国内外不少学者对试验方法改进，如增加刺激性指标如耳缘厚度和耳重的检测［7］;分析免疫表型 B220+［8］，CD69+［9］等;将淋巴结增殖情况(称重和计数)纳入致敏性指标［10］。2010年，OECD又增加了两种新的方法，即 LLNA:DA方法(TG442A)［11］和 LLNA: Brdu-ELISA方法(TG442B)［12］。这两种方法弥补了TG429方法放射性物质的污染的缺陷，但仍有一定制约性，如LLNA:DA的试验结果受检测时间影响较大，OECD标准要求:从取淋巴结到检测过程须在20 min内完成，且每只动物的检测时间要保持一致，从处死到 ATP检测约在 30 min内完成［11］。LLNA:BrdU-ELISA法难免存在由于皮肤刺激剂或者呼吸道致敏剂引发的假阳性对检测的干扰［12］。

2.2 正在研究和验证的LLNA改良法

近几年，研究者们继续对LLNA改良法进行不断改进和探索［13-16］，Ulker［13］对LLNA:Brdu方法进行改良，增加淋巴结细胞的Th1型和Th2型细胞因子的指标测定，对三种不同的致敏物质，结果表明改良LLNA:Brdu和放射性LLNA方法的致敏检测结果一致性良好。阳晓燕［14］用 LLNA:DA改良法对4种化妆品原料和6种化妆品产品进行致敏检测，增选耳厚差、耳重为刺激指标，淋巴结重量、淋巴细胞数和 ATP发光值为致敏指标，将刺激指标和致敏指标结合对化妆品刺激性和致敏性做出综合评价。

Yamashita等［15］用一种包含激发阶段的改良法—LLNA:DAE法区分LLNA:DA检测中出现的边界阳性化合物，并进行交叉致敏测试。该方法对实验动物右耳背部进行4次化学物质接触诱导，最后对左耳背部进行激发反应，通过测试发现包括边界阳性的24种化学物质中，23种化学物质的检测结果与 LLNA方法一致。Yamashita［16］等对 LLNA: DAE法进行进一步探索试将其作为一种独立的皮肤致敏检测方法来评估不同之间的相对皮肤致敏效力，他对3种化学物(己基肉桂醛、异丁子香酚和2，4-二硝基氯苯)进行初步剂量研究，发现32种化合物的左耳淋巴结激发反应程度和致敏效力之间存在一定的定性关系。

目前，利用流式细胞术对LLNA改良方法(flow cytometry-based LLNA，FC-LLNA)包括:(1)流式细胞术检测细胞增殖:流式细胞术(flow cytometry，FCM)能通过测定淋巴结细胞中的 BrdU快速、灵敏地检测细胞增殖［17］;(2)流式细胞术检测细胞亚群及致敏相关标志物:如CD40L，CD62L等［18］;(3)流式细胞术进行致敏相关细胞因子检测:IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNFα［19］。该方法在敏感度和准确率方面展示出较好的前景，但仍未通过OECD的方法学认证［20］。

2 皮肤致敏体外替代试验

2.1 直接肽反应试验 Direct Peptide Reactivity Assay(DPRA)

化学物穿透皮肤后，大多数化学物可与皮肤蛋白质结合形成稳定的免疫复合物启动免疫反应。由于这些化学致敏原大多是亲电性的，因此可以与氨基酸的亲核中心共价结合。DPRA实验的设计是通过量化包含半胱氨酸和赖氨酸的合成肽模型的化学物质的活性，来模拟亲电子化学物质和亲核中心的共价结合过程。该试验研究肽反应动力学，将受试物孵育24小时后，用高效液相HPLC测肽的残留量来评价化学物质的致敏性，它能将化合物按照不同致敏程度进行分类［21］。

该方法由 Gerberick和他的同事在 2004年开发［22］，2007年进行改良［23］。为了拓宽该方法的使用范围，2009年Gerberick又进一步改良，在致敏物与半胱氨酸的酶促反应中加入了辣根过氧化物酶—过氧化氢(HRP/P)，使该方法也能用于抗原前体物的检测［24］。2013年，欧洲替代方法研究中心(European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing(EURL-ECVAM)将其作为皮肤致敏替代试验的推荐方法［25］，2015年2月，OECD公布DPRA试验方案(TG442C)［21］。

2.2 树突状细胞检测法

树突状细胞DC能将抗原递呈给初级免疫T细胞，调节T细胞、B细胞介导的免疫应答，皮肤朗格罕细胞(Langerhans cell，LC)是主要位于表皮的未成熟树突状细胞(iDC)。在抗原递呈的过程中，iDC捕获和处理抗原，刺激T淋巴细胞活化并引起多种生物学变化，通过检测DC生物学指标的变化，可评价化学物的致敏性。目前，检测比较成熟的细胞因子是 IL-1β，TGF和 TNF-α，膜表面分子主要有CD86，CD54，和MHC II［26、27］。

LC样树突状细胞模型来源主要是诱导培养CD34+造血干细胞和外周血获得的树突状细胞，但此类细胞模型存在着不足:实验室之间、来源个体间差异性、、费用昂贵等。为克服这些限制，目前一些来源广泛，活力较强的各类单核细胞系(THP1、U937和 MUTZ-3等)成为目前研究的热点内容［29］。

2.3 人细胞系激活实验 (human cell line activation test，h-CLAT)

由于人单核白血病细胞 THP-1(human monocytic leukaemia cell line)能表现出与树突细胞类似的性质，并在细胞因子的作用下分化为树突样细胞。当与致敏物接触时，THP-1细胞表面的CD86和 CD54表达增强，从而使其成为有效的评价皮肤致敏的体外研究方法［30］。h-CLAT试验采用THP-1进行体外皮肤致敏研究，通过检测细胞表面标志物CD86和 CD54的变化来反映化学物的致敏性。THP-1细胞不需要细胞因子诱导，即可被致敏物激活，目前细胞已商品化，对常用致敏物检测特异性高。h-CLAT法已经初步获得认可，通过不同国家实验室间的合作研究验证，欧洲替代方法研究中心(EURL-ECVAM)已完成了对它的可行性验证［31］，2015年12月，OECD已经公布了 h-CLAT的方法草案［32］。

Ashikaga等［33］通过检测细胞 CD86和 CD54的表达水平对100种化学物致敏性的进行判定，h-CLAT与 LLNA结果的一致性仍然高达 84%，h-CLAT不仅能分辨出极度致敏和强致敏，而且能分辨出中度致敏和弱致敏。Parise等［34］发现给药暴露48 h后，可以用h-CLAT法通过分析THP-1的CD86的表达水平将23种致敏物质的22种鉴定出来，结合CD86和IL-8的分析对致敏物做综合判断。

2.4 ARE-Nrf2荧光素酶检测法(KeratinoSensTM)

Nrf2是携带有亮氨酸拉链结构的转录因子，几乎能在所有细胞中表达，它含6个功能区，分别被命名为Neh1～6。正常情况下，其在胞质中通过 Neh2与阻遏蛋白Keap1蛋白结合而被降解。当机体处于氧化应激状态或体内的氧化磷酸化作用可以促使Nrf2与Keap1解体，随后 Nrf2转位进入细胞核，在各个功能区的密切配合下与抗氧化/亲电反应元件(antioxidant/electrophile response element，ARE)结合，启动 Nrf2-ARE信号通路并促使下游II相解毒酶和抗氧化酶基因的表达［35］。

HaCaT(human keratinocytes)是人类永生化角质细胞，包含有ARE元件的荧光素酶报告基因，Nrf2-ARE检测就是利用HaCaT细胞检测荧光素酶的活力水平来判断细胞是否有致敏反应。EURL ECVAM公布的数据显示，该方法在不同实验室间的可重复率达到85%，准确性和 LLNA相比达到77%，特异性达到76%，并于2014年2月推荐该方法的试验方案［36］，2015年2月OECD公布了该方法的指导原则(TG442D)［37］。

2.5 人工皮肤/重建表皮模型

现在主要有两种类型的体外三维培养人皮肤模型:表皮类似物或皮肤类似物。

已经商品化并被欧盟推荐使用的重组人皮肤模型有EpiskinTM、EpidermTM和SkinEthic RHE［38］等，张广静［39］等研究表明永生化细胞组织工程皮肤模型检测的敏感性和特异性均高于原代培养细胞构建的皮肤模型。Ramadan等［40］2016年模拟皮肤内环境，利用动态灌流微培养系统构建人永生化细胞HaCaT和人白血病单核淋巴细胞(U937)共培养的三维模型。曹玉萍［41］等将 THP-1细胞分别与 KC和色素性组织工程表皮共培养三维模型，通过检测THP-1细胞表面的标记物变化及培养液中细胞因子的变化来判断待检物质的致敏性。

2.6 结构活性关系分析

化合物的生物学特性与其化学结构密切相关，有许多理论电脑模型能利用与未知化学物结构近似的已知化学物的现有理化资料预测该未知化学物的理化特性。如结构活性关系分析(structural activity relationship，SAR)和定量结构活 性 分 析 ( quantitative structural activity relationship，QSAR)。Gould［42］将LLNA实验中存在潜在致敏力的28种化合物(EC3＜1%)用计算机进一步DEREK分析，从结构，理化性质方面，如分子量，LogP等参数，结合结构性预警分析和理化分析对LLNA结果进行综合判断，结构性分析显示其中13种化合物阴性，15种化合物阳性，所有化合物的分子量均小于550 Da，对其中21种化合物进行 EC3值分析，8种是 EC3值的数量级是正确的，8种不正确，5种不能判定。通过结合计算机结构及理化分析能对LLNA结果做出更准确的判断。Urbisch［43］等用QSAR Toolbox方法和DPRA方法相比在致敏性判断结果上有84%的一致性。其中非致敏物质判断一致性83% ～100%，致敏物质判断一致性55% ～61%。Dimitrov等［44］在 2015年建立一种对体内、体外测试试验(DPRA vs.LLNA)结果转换时进行数据整合和分析的统计学方法，这套方法的分级和筛选方式不仅能用于皮肤试验评估，还能用于化学物体内外毒理和健康评价及QSAR模型的建立。

目前还没有一种体外测试方法的结果能完全代替动物试验单独用于化学物皮肤致敏性评估，每一种体外方法只能反应皮肤致敏不良反应结局路径(AOP)中的一部分关键信息，不能完整的反应整个皮肤致敏机制过程。一种新的替代方法的建立首先必须具备能体现3R原则、科学、有效及可操作性等优势，经欧盟验证实验室(EU-NETVAL)验证其数据可重复性，与体内动物试验方法要有相关性和一致性，其结果能够较好地预测受试物的毒理学及生物学效应。然后国际和各国权威部门组织同行评议和方法学验证，如ECVAM、ICCVAM(NICEATM)等。再后，根据专家的评估意见提交相关管理部门，如欧盟委员会评估同意接受可成为欧盟方法纳入法规管理的轨道。如要成为 OECD的标准，还需更广泛机构的验证和反复修改，还要听取社会评论，才能发布为OECD的试验指南。［45，46］近年来，研究人员采用组合测试策略(ITS)将DPRA、h-CLAT、KeratinoSensTM结合LLNA和计算机模拟的数据组合分析、已涵盖皮肤致敏的各阶段的生化反应数据，构建皮肤致敏性评价的框架。Urbisch［47］等结合DPRA，KeratinoSensTM和h-CLAT三种检测方式，将27种抗原前体物中的22种检测出来，阳性致敏率达到81%。Strickland等结合了LLNA，DPRA，h-CLAT和ARE-Nrf2荧光素酶检测法建立一种整体评估策略，利用计算机QSAR Toolbox分析影响皮肤渗透力的6种相关理化性质参数，建立 54种不同的 QSAR Toolbox计算机模型。

经过20多年的不断研究和探索，致敏免疫反应分子研究的逐渐清晰，为体外构建可靠的化学物致敏性评价体系奠定了理论基础，随着欧盟相关法规禁止使用动物实验进行化妆品安全性评价的推进，致敏体外替代实验的研究进程也在不断加快，更多的经过欧洲替代方法验证中心(ECVAM)确认的方法正在得到认可，替代实验的研究具有广阔的前景，我国在替代实验研究方面刚刚起步，应加快替代实验在国内实验室的普及和开展，推动替代实验的不断发展。

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Research progress of alternative in vitro methods to evaluate skin sensitization

CHEN Ning1，WANG Ping1，XIAN Jing-wen1，XIE Tian-zhu1，Qin Mei-rong1，LI Jun-peng1，LU Yi1，WANG Xiao-wei1，SHI Hai-ning2，LONG Shao-rong3
(1.Shenzhen Institute for Drug Control，Shenzhen，518057，China;2.Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School，Boston，02114，USA;School of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou，450000，China)

Skin sensitization(allergic contact dermatitis，ACD)，is a serious condition caused by small reactive molecules and is characterized by a delayed-type hypersensitivity.Animal tests were usually used in the evaluation of sensitizing potential of chemical substances in the past.However，there is an increasing interest from the public for reducing and ultimately replacing animal tests.The European Union(EU)has posed a ban on animal testing of cosmetic ingredients that includes skin sensitization since 2013.Therefore，alternative in vitro tests are the main tendency in chemical substances and cosmetic sensitizing potential research in the future.In this study，different kinds of in vitro test methods that were adopted by OECD or on research(LLNA，DPRA，KeratinoSensTM，h-CLAT)were reviewed through recent years literature，comprehensive introduction and evaluation were made to obtain reliable hazard and potency information on potential skin sensitizers.

Skin sensitization;Allergic contact dermatitis;Alternative in vitro testing;Cosmetics

R-33

A

1671-7856(2016)12-0085-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.017

2016-06-14

深圳市药品检验研究院重点学科团队建设项目。

陈宁(1982-)，主管药师，博士，研究方向:药理毒理学，E-mail:cn82cn@163.com。

王平(1972-)，主任药师，博士，研究方向:药理毒理学，E-mail:wangping662@sina.com。