长链非编码RNA linc-STXBP5-1在宫颈癌中的表达及其干预效应分析*

邹阮敏，　余　霞，　张文淼，　陈冠阁，　朱　华△，　苏华芳

(温州医科大学附属第一医院1妇产科，2病理科，3放化疗科，浙江 温州 325000)



长链非编码RNA linc-STXBP5-1在宫颈癌中的表达及其干预效应分析*

邹阮敏1，余霞2，张文淼1，陈冠阁1，朱华1△，苏华芳3△

(温州医科大学附属第一医院1妇产科，2病理科，3放化疗科，浙江 温州 325000)

[摘要]目的： 检测长链非编码RNA linc-STXBP5-1在宫颈癌组织中的表达及意义，细胞学水平分析其对宫颈癌细胞活力及侵袭力的影响。方法: Real-time PCR检测48例宫颈鳞癌组织、9例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ-Ⅲ、20例CINⅠ和20例正常宫颈组织 linc-STXBP5-1的表达水平；分析linc-STXBP5-1在不同病理级别和临床分期宫颈鳞癌中的表达情况； linc-STXBP5-1 siRNA干预HPV16(+) SiHa宫颈癌细胞后，检测细胞活力；Transwell侵袭实验检测沉默linc-STXBP5-1后SiHa宫颈癌细胞的侵袭能力；最后检测linc-STXBP5-1在宫颈癌细胞胞浆及胞核的定位表达。结果: 宫颈鳞癌及CINⅡ-Ⅲ组织linc-STXBP5-1表达明显高于CINⅠ及正常宫颈组织(P<0.05)；宫颈鳞癌与CINⅡ-Ⅲ之间以及CINⅠ与正常宫颈组织间linc-STXBP5-1表达差异无统计学显著性；linc-STXBP5-1表达与宫颈癌临床病理分析显示，病理分级属于G3的宫颈鳞癌组织linc-STXBP5-1的表达量明显高于G1、G2组织(P<0.05)；临床分期中属于Ⅲ和Ⅳ期的宫颈鳞癌组织也明显高于Ⅰ和Ⅱ期(P<0.05)；linc-STXBP5-1表达水平与不同年龄、肿瘤直径和肿瘤类型未见显著相关性。利用siRNA下调SiHa宫颈癌细胞linc-STXBP5-1表达后，细胞活力和侵袭能力显著降低；定位表达分析提示linc-STXBP5-1主要表达于宫颈癌细胞的细胞核中，仅有少许表达于细胞浆中。结论: 肿瘤组织上调表达的linc-STXBP5-1可作为促癌基因参与宫颈癌的发生发展过程。

[关键词]长链非编码RNA； 宫颈癌； 细胞活力； 细胞侵袭

非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)，尤其是转录本长度超过200 nt的长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)与肿瘤的关系近年来受到重视。许多研究均证实，异常表达的lncRNA参与了多种肿瘤的发生发展进程[1-2]。Linc-STXBP5-1是一条定位于Chr6:147480061-147502128、长度为453 nt的lncRNA。我们前期的lncRNA表达谱芯片检测显示，与正常宫颈组织比较，linc-STXBP5-1在宫颈癌组织中表达明显上调。本研究进一步检测48例宫颈癌组织、19例宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)Ⅱ-Ⅲ、20例CINⅠ及20例正常宫颈组织linc-STXBP5-1的表达，分析其表达与宫颈癌临床病理特征的关系，并在细胞水平进行干预，分析细胞基本生物学特征的变化，探讨其在宫颈癌发生、发展中可能的调控作用及意义。

材料和方法

1实验材料

SiHa宫颈癌细胞株购自中科院上海科学研究所细胞库；DMEM培养基、胎牛血清、Opti-MEM培养基、0.05% trypsin、脂质体(Lipofectamine 2000) 和TRIzol试剂购自Invitrogen；ReverTra Ace逆转录试剂盒、SYBR Master Mix等购自Toyobo；胞核和胞浆蛋白提取试剂盒购自Thermo Fisher；Matrigel购自BD Bioscience；Transwell小室购自Costar；CCK-8试剂盒购自Dojindo。siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

2实验方法

2.1标本采集48例宫颈鳞癌组织取自温州医科大学附属第一医院2012年1月～2014年9月就诊患者，活检取材，之前均未行手术和放、化疗。患者年龄34～70岁，中位年龄48.7岁。肿瘤直径<4 cm 19例，≥4 cm 29例。肿瘤类型：外生型19例，内生型15例，溃疡型10例，颈管型4例。病理分级：G1 10例，G2 14例，G3 24例。临床分期：按国际妇产科联盟(FIGO)的分期标准，Ⅰ期8例，Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期14例。19例CINⅡ-Ⅲ患者年龄31～58岁，中位年龄45.6岁。20例CINⅠ患者年龄34～55岁，中位年龄41.4岁。另取同期年龄匹配的应子宫肌瘤手术的正常宫颈组织20份作对照。标本离体后30 min内置于液氮保存。宫颈癌、CIN诊断及常规病理资料由2位病理科医师盲法阅片后提供。

2.2RNA的提取取液氮保存的组织标本，在液氮中碾碎至粉状，按TRIzol试剂说明书提取总RNA。为去除可能污染的DNA，抽提的RNA经DNaseⅠ处理、酚-氯仿抽提后，纯化的RNA以DEPC水溶解。利用Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA浓度和完整性。 提取SiHa细胞RNA，依照胞浆胞核分离提取试剂盒操作。

2.3Linc-STXBP5-1表达的检测参照ReverTra Ace逆转录试剂盒说明书，取4 μg总RNA以随机引物(hexamer)进行逆转录。反应条件为42 ℃ 60 min、75 ℃ 15 min, 反应结束后-20 ℃保存。以20 μL反应体系进行定量PCR检测。表1为相关的引物序列。定量荧光PCR反应体系包括1 μL 逆转录产物、1×SYBR Green I Master Mix、0.5 μmol/L特异前向引物和0.5 μmol/L 特异反向引物。反应条件为95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min，40 个循环。Real-time PCR使用ABI Step One仪器进行。所有样品做3复孔。根据待测标本的Ct值，以GAPDH作为内参照，采用2-ΔΔCt法计算目的基因表达。

2.4Linc-STXBP5-1干预对细胞活力的检测HPV16(+) SiHa宫颈癌细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基, 置于37 ℃、含5% CO2饱和湿度培养箱内培养, 2～3 d传代 1 次。状态良好的细胞以每孔1×105细胞(100 μL)接种96孔板，linc-STXBP5-1 siRNA转染细胞，设20 nmol、40 nmol/L和80 nmol/L 3个不同浓度的siRNA干预组、无关序列对照组及不含siRNA的空白组。按Lipofectamine 2000说明书转染细胞。转染48 h后，加入CCK-8溶液(每孔10 μL)，继续培养4 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

2.5Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力按Costar 24-Well TranswellTM说明书操作。将冻存于-20 ℃的Matrigel 4 ℃过夜预冷成液态，无血清培养液将Matrigel冰上操作1∶1稀释，混匀后加入Transwell小室，每孔15 μL。37 ℃包被1 h，无血清培养液洗3次后备用。消化SiHa细胞后用无血清培养液洗2次，计数。向上部培养嵌室内加入细胞悬液(含1×105个细胞)并加入无血清DMEM稀释至400 μL，每组设3个复孔。向底部培养室加入600 μL含15% FBS的DMEM完全培养液。37 ℃、5% CO2培养24 h。吸去嵌室内的液体，用棉棒擦去嵌室底部内表面上的细胞，将嵌室浸入固定液(50%甲醇)固定15 min，PBS洗3遍。结晶紫染色30 min。风干后，荧光显微镜下每个培养孔随机选择6个视野拍照计数并计算每个视野的平均数。

3统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理。宫颈组织linc-STXBP5-1表达以中位数和四分位数间距表示，两组间差异分析采用Mann-WhitneyU检验，多组差异表达分析采用Kruskal-WallisH检验；细胞实验的数据以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析及Bonferroni检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1宫颈鳞癌、CIN及正常宫颈组织linc-STXBP5-1的表达

以GAPDH为内参照，linc-STXBP5-1在宫颈鳞癌、CINⅡ-Ⅲ、CINⅠ及正常宫颈组织中的相对表达量分别为16.73(3.92，28.49)、12.46(5.55，17.50)、4.46(0.91，7.21)和2.05(0.58，3.20)。秩和检验结果表明，宫颈鳞癌及CINⅡ-Ⅲ的linc-STXBP5-1表达明显高于CINⅠ及正常宫颈组织(P<0.05)，且宫颈鳞癌与CINⅡ-Ⅲ之间以及CINⅠ与正常宫颈组织间linc-STXBP5-1表达差异无统计学显著性，见图1。

Figure 1.Expression of linc-STXBP5-1 in cervical cancer (CC), CINⅡ-Ⅲ, CINⅠ and normal cervical (NC) tissues.*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsCINⅠ.

图1宫颈鳞癌、CINⅡ-Ⅲ、CINⅠ及正常宫颈组织中linc-STXBP5-1的表达水平

2Linc-STXBP5-1表达与宫颈鳞癌临床病理特征相关性分析

如表2 所示，linc-STXBP5-1表达在不同病理分级及临床分期的宫颈鳞癌组织存在明显差异(P<0.05)，病理分级属于G3的宫颈鳞癌组织linc-STXBP5-1的表达量明显高于G1、G2组织(P<0.05)；临床分期中属于Ⅲ和Ⅳ期的宫颈鳞癌组织也明显高于Ⅰ和Ⅱ期(P<0.05)。Linc-STXBP5-1表达水平与不同年龄、肿瘤直径和肿瘤类型未见显著相关性。

表2Linc-STXBP5-1表达与宫颈癌临床病理因素的相关性分析

Table 2.Correlation between clinicopathological features and linc-STXBP5-1 expression in 48 specimens

*The data were presented as median and interquatile range.

3沉默linc-STXBP5-1的对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响

为分析linc-STXBP5-1的效应，本研究进一步利用siRNA沉默HPV16(+) SiHa细胞株中linc-STXBP5-1表达。20、40和80 nmol/L siRNA干预均可明显降低细胞内linc-STXBP5-1的表达。40 nmol/L siRNA与50 nmol/L siRNA干扰效果差异无统计学意义，为此选择40 nmol/L 进行后续干预实验。如图2所示，40 nmol/L siRNA干预后，CCK-8法检测发现细胞活力显著降低。如图3所示，Transwell小室侵袭实验检测迁移侵袭能力发现，沉默linc-STXBP5-1可显著降低细胞的侵袭能力。

Figure 2. The viability of SiHa cells after by silencing of linc-STXBP5-1.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control (NC).

图2沉默linc-STXBP5-1对SiHa细胞活力的影响

Figure 3.The cell invasion after silencing of linc-STXBP5-1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

图3沉默linc-STXBP5-1对SiHa细胞侵袭能力的影响

4Linc-STXBP5-1在宫颈癌细胞的定位表达分析

利用胞浆胞核分离提取试剂盒，分别提取SiHa细胞的胞浆及胞核RNA，利用real-time PCR方法检测linc-STXBP5-1的表达水平，如图4，结果发现该lncRNA主要表达于细胞核中，仅有少许表达于细胞浆中。

Figure 4.The subcellular localization of linc STXBP5-1 expressed in the SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscytoplasm.

图4linc-STXBP5-1在SiHa细胞株中的亚细胞定位表达

讨论

近年越来越多的研究表明，lncRNA在转录水平、转录后水平以及表观遗传等多个层面参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程[3]，异常表达的lncRNA不但是肿瘤特异标记物，也可以作为肿瘤治疗的分子靶点[4]。但lncRNA与宫颈癌关系的研究目前尚处于起步阶段。有报道MALAT1、HOTAIR、CCHE1、CCAT2、CET、EBIC等lncRNA的上调表达和MEG3、LET及GAS5等的下调表达参与促进宫颈癌的发生发展[5-10]。

Linc-STXBP5-1是一条定位于人染色体6q24.3、长度为453 nt的典型基因间lncRNA[11]。其功能迄今尚未有相关研究报道。我们前期lncRNA表达谱芯片检测显示，与正常宫颈组织比较，linc-STXBP5-1在宫颈癌组织中表达明显上调。本研究通过real-time PCR进一步证实了芯片筛选的结果。分析其在CINⅡ-Ⅲ和CINⅠ组织表达显示，linc-STXBP5-1不但在宫颈癌，而且在CINⅡ和Ⅲ的表达也明显高于CINⅠ及正常宫颈组织。与宫颈癌临床病理特征相关分析显示，病理分级属于G3的宫颈鳞癌组织linc-STXBP5-1的表达量明显高于G1、G2组织，临床分期中属于Ⅲ和Ⅳ期的宫颈鳞癌组织明显高于Ⅰ和Ⅱ期宫颈鳞癌组织。沉默宫颈癌细胞linc-STXBP5-1表达后，可显著降低其活力及侵袭能力，提示linc-STXBP5-1是宫颈癌的一个新的促癌基因。既往的研究发现，宫颈肿瘤组织上调表达的MALAT1和HOTAIR可促进宫颈癌细胞活力、侵袭和迁移，可作为宫颈癌不良预后的一个生物标志[9,12-15]。本研究发现的linc-STXBP5-1也将是一个新的宫颈癌诊断生物标志及潜在的治疗靶点。

目前仅少数的lncRNA在宫颈癌中的作用机制被阐明。MALAT1可通过miR-124、miR-145及上皮细胞转分化等作用参与宫颈癌的发展[12,16-17]，而HOTAIR不但可通过调节VEGF、MMP-9及其它EMT相关基因表达促进宫颈癌细胞增殖迁移[13-15]，而且可抑制p21促进宫颈癌恶性表型和放射治疗的抵抗[18]。但是，关于linc-STXBP5-1调控机制迄今尚无相关研究报道。本研究通过检测细胞核和细胞浆中的表达情况，发现linc-STXBP5-1主要分布于细胞核内。研究显示，约50%的lincRNA可通过招募多种染色质修饰复合物，如PCR2蛋白复合体，发挥表观遗传学调控作用[19]。而基因组染色体上linc-STXBP5-1相邻的区域含TCF21、SYNE1、AKAP12、IL20RA、ACAT2等高度甲基化的抑癌基因[20]。是否linc-STXBP5-1通过招募染色体修饰复合物影响其邻近区域抑癌基因启动子区的表观遗传学调控有待进一步研究。

[参考文献]

[1]Tsai MC, Spitale RC, Chang HY. Long intergenic noncoding RNAs: new links in cancer progression[J]. Can-cer Res, 2011, 71(1):3-7.

[2]Spizzo R, Almeida MI, Colombatti A, et al. Long non-coding RNAs and cancer: a new frontier of translational research? [J]. Oncogene, 2012, 31(43):4577-4587.

[3]Batista PJ, Chang HY. Long noncoding RNAs: cellular address codes in development and disease[J]. Cell, 2013, 152(6):1298-1307.

[4]Huarte M. The emerging role of lncRNAs in cancer[J]. Nat Med, 2015, 21(11):1253-1261.

[5]Peng L, Yuan X, Jiang B, et al. LncRNAs: key players and novel insights into cervical cancer[J]. Tumour Biol, 2016，37(3)：2779-2788.

[6]Sharma S, Mandal P, Sadhukhan T, et al. Bridging Links between long noncoding RNA HOTAIR and HPV oncoprotein E7 in cervical cancer pathogenesis[J]. Sci Rep, 2015, 5:11724.

[7]Yang M, Zhai X, Xia B,et al. Long noncoding RNA CCHE1 promotes cervical cancer cell proliferation via upregulating PCNA[J]. Tumour Biol, 2015, 36(10): 7615-7622.

[8]Zhang J,Yao T, Wang Y, et al. Long noncoding RNA MEG3 is downregulated in cervical cancer and affects cell proliferation and apoptosis by regulating miR-21[J]. Cancer Biol Ther, 2016, 17(1):104-113.

[9]Yang L, Bai HS, Deng Y, et al. High MALAT1 expression predicts a poor prognosis of cervical cancer and promotes cancer cell growth and invasion[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2015, 19(17):3187-3193.

[10]Li J,Wang Y,Yu J, et al. A high level of circulating HOTAIR is associated with progression and poor prognosis of cervical cancer[J]. Tumour Biol, 2015, 36(3):1661-1665.

[11]Rinn JL, Chang HY. Genome regulation by long noncoding RNAs[J]. Annu Rev Biochem, 2012, 81:145-166.

[12]Lu H, He Y, Lin L, et al. Long non-coding RNA MALAT1 modulates radiosensitivity of HR-HPV+ cervical cancer via sponging miR-145[J]. Tumour Biol, 2016,37(2):1683-1691.

[13]Wu Y, Zhang L, Zhang L, et al. Long non-coding RNA HOTAIR promotes tumor cell invasion and metastasis by recruiting EZH2 and repressing E-cadherin in oral squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol, 2015, 46(6):2586-2594.

[14]Huang L, Liao LM, Liu AW, et al. Overexpression of long noncoding RNA HOTAIR predicts a poor prognosis in patients with cervical cancer[J]. Arch Gynecol Obstet, 2014, 290(4):717-723.

[15]Li D, Feng J, Wu T, et al. Long intergenic noncoding RNA HOTAIR is overexpressed and regulates PTEN methylation in laryngeal squamous cell carcinoma[J]. Am J Pathol, 2013, 182(1):64-70.

[16]Liu S, Song L, Zeng S, et al. MALAT1-miR-124-RBG2 axis is involved in growth and invasion of HR-HPV-positive cervical cancer cells[J]. Tumour Biol, 2016,37(1):633-640.

[17]Sun R, Qin C, Jian B, et al.Down-regulation of MALAT1 inhibits cervical cancer cell invasion and metastasis by inhibition of epithelial-mesenchymal transition[J]. Mol Biosyst, 2016, 12(3):952-962.

[18]Jing L,Yuan W, Ruofan D, et al. HOTAIR enhanced aggressive biological behaviors and induced radio-resistance via inhibiting p21 in cervical cancer[J]. Tumour Biol, 2015, 36(5):3611-3619.

[19]Khalil AM, Guttman M, Huarte M, et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(28): 11667-11672.

[20]Tessema M, Willink R, Do K, et al. Promoter methylation of genes in and around the candidate lung cancer susceptibility locus 6q23-25[J]. Cancer Res, 2008, 68(6):1707-1714.

(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Expression and intervention effect of long noncoding RNA linc-STXBP5-1 in cervical cancer

ZOU Ruan-min1, YU Xia2, ZHANG Wen-miao1, CHEN Guan-ge1, ZHU Hua1, SU Hua-fang3

(1DepartmentofObstetrics&Gynecology,2DepartmentofPathology,3DepartmentofRadiationOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail: 23444176@qq.com; 12602639@qq.com)

[KEY WORDS]Long noncoding RNA; Cervical carcinoma; Cell viability; Cell invasion

[ABSTRACT]AIM: To determine the expression of long noncoding RNA linc-STXBP5-1 in cervical cancer and its clinical significance, and to further explore its effect on the viability and invasion of cervical cancer cell line.METHODS: The expression levels of linc-STXBP5-1 in the cervical squamous-cell carcinoma tissues, cervical intraepithelial neoplasia (CIN)Ⅱ-Ⅲ, CINⅠ, and normal cervical tissues were detected by real-time PCR. The correlation between linc-STXBP5-1 expression and clinicopathological features of cervical cancer was further analyzed. Linc-STXBP5-1 knockdown was established by transfecting siRNA into human cervical cancer SiHa cells. The effect of linc-STXBP5-1 on cell viability and invasion ability was evaluated by CCK-8 assay and transwell assay, respectively. To determine the subcellular localization of linc-STXBP5-1 expression, the nuclear and cytoplasmic RNA fractions were isolated, and linc-STXBP5-1 expression was quantified by real-time PCR.RESULTS: Compared with CINⅠand normal cervical tissues, the level of linc-STXBP5-1 was significantly upregulated in the cervical squamous-cell carcinoma and CINⅡ-Ⅲ (P<0.05). No significant difference was observed either between the cervical squamous-cell carcinoma and CINⅡ-Ⅲ, or between CINⅠ and the normal cervical tissues. The clinical correlation analysis suggested that linc-STXBP5-1 expression in G3 cervical squamous-cell carcinoma tissues was obviously higher than that in G1 and G2 (P<0.05). At the same time, linc-STXBP5-1 expression in the cervical squamous-cell carcinoma with stage Ⅲ -Ⅳ was significantly higher than that with stage Ⅰ-Ⅱ (P<0.05). The expression level of linc-STXBP5-1 did not relate to age, tumor size and tumor type. Knockdown of linc-STXBP5-1 expression by siRNA reduced the viability and invasion in HPV16 (+) SiHa cervical cancer cells. Analysis of subcellular localization indicated that the transcript of linc-STXBP5-1 was mainly expressed in the nucleus of SiHa cells, rarely in cytoplasm. CONCLUSION: The upregulation of linc-STXBP5-1 expression may function as an oncogene in the development and progression of cervical carcinoma.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1127- 06

[收稿日期]2016- 03- 24[修回日期] 2016- 04- 26

*[基金项目]浙江省自然科学青年基金科研资助项目(No. LQ15C010002);温州市科技局科研基金资助项目(No. Y20140308)

通讯作者△Tel: 0577-88069216; E-mail: 朱华 23444176@qq.com; 苏华芳 12602639@qq.com

[中图分类号]R730.23；R711.74

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.028