盐皮质激素受体阻断剂对SiO2诱导的肺巨噬细胞表型偏移的调节*

苏程程，　张译丹，　向国安，　马永强，　周　欣，　彭守春，　魏路清△，　姬文婕△

(1中国人民武装警察部队后勤学院附属医院呼吸与重症医学科,2天津市心血管重塑与靶器官损伤重点实验室，天津 300162;3中国人民武装警察部队福建总队医院，福建 福州350000)



▲ 并列第1作者

盐皮质激素受体阻断剂对SiO2诱导的肺巨噬细胞表型偏移的调节*

苏程程1▲，张译丹3▲，向国安1，马永强2，周欣2，彭守春1，魏路清1△，姬文婕1△

(1中国人民武装警察部队后勤学院附属医院呼吸与重症医学科,2天津市心血管重塑与靶器官损伤重点实验室，天津 300162;3中国人民武装警察部队福建总队医院，福建 福州350000)

[摘要]目的： 研究盐皮质受体阻断剂螺内酯(spirolactone，SPI)对二氧化硅(SiO2)诱导的肺巨噬细胞表型偏移的影响。方法: 将60只C57BL/6小鼠随机分为生理盐水(NS)组、SiO2组、SPI治疗组(SiO2+SPI组)及溶剂对照组(SiO2+NS组)，经口咽吸入SiO2悬浊液(40 mg/kg)建立矽肺模型，对照组给予等量生理盐水，SiO2+SPI组在造模后每天经口灌胃给予SPI(10 mg·kg-1·d-1)，SiO2+NS组以相同方式给予等量生理盐水。造模后3 d、14 d、28 d取材，进行肺泡灌洗，取灌洗液细胞进行定量、分类计数及流式细胞术分析，右下肺叶用酶解法制成单细胞悬液行流式细胞术分析。结果: 与SiO2组相比，SPI治疗可以明显降低SiO2干预后3 d、14 d支气管肺泡灌洗液总细胞数及巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞数。SiO2干预后14 d、28 d，肺泡巨噬细胞和间质巨噬细胞由M1表型向M2表型偏移，SPI治疗可以有效逆转SiO2诱导的巨噬细胞表型偏移。结论: SPI可以减轻SiO2导致的肺泡炎症细胞浸润，可能是通过逆转SiO2诱导的巨噬细胞表型偏移实现的。

[关键词]二氧化硅； 盐皮质受体； 螺内酯； 巨噬细胞

矽肺是由于长期吸入二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)颗粒引起的以肺部广泛的结节性纤维化为特征的职业性肺疾病，是尘肺中最常见、也是最具危害性的一种;由于脱离暴露因素仍进行性发展且缺乏有效的治疗方法，该病严重威胁各国特别是广大发展中国家相关从业人员的健康[1-2]。相关研究表明，肺巨噬细胞在矽肺的发病机制中发挥重要作用：SiO2进入呼吸道后被肺巨噬细胞吞噬，导致溶酶体破坏，并激活NALP3炎症复合体，触发炎症级联反应并促进纤维化形成[3]。巨噬细胞具有异质性，在疾病的不同阶段受内环境各种因子的影响转变为最具优势的表型，发挥不同的功能[4]。巨噬细胞按激活状态可以分为经典激活巨噬细胞(M1表型)和替代激活巨噬细胞(M2表型)，分别与Th1和Th2免疫反应有关[4-5]。现有研究表明巨噬细胞表型变化与慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等疾病的形成密切相关[6]。

盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，MR)是一种典型的胞核甾体类激素受体，广泛表达于肾脏、肺脏、免疫系统、神经组织以及心脏等部位[7-9]。在之前的研究中我们使用MR阻断剂螺内酯(spirolactone，SPI)减轻了矽肺小鼠肺组织炎症及纤维化，且前期研究表明阻断MR可以对博来霉素(bleomycin，BLM)导致的肺巨噬细胞表型变化起到有效的调控作用[10]，而SiO2能否引起小鼠巨噬细胞表型偏移及阻断MR能否调节巨噬细胞表型的偏移尚未见文献报道。本实验拟探讨SiO2诱导对小鼠肺巨噬细胞表型的影响，并研究SPI能否对巨噬细胞表型的偏移起到调控作用。

材料和方法

1 动物和试剂

6～8周龄雄性C57BL/6小鼠，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号为SCXK-(军)2012-0004。小鼠在通风、温度和湿度适宜的清洁级动物室内常规饲养，适应性饲养1周后用于实验。

螺内酯、0.5～10 μm SiO2(Sigma)；Ⅰ型胶原酶(Gibco)；PerCP/Cy5.5标记的抗小鼠CD64抗体、PE/Cy7标记抗小鼠CD11b抗体、phycoerythrin PE标记抗小鼠CD206抗体、碘化丙啶(propidium iodide，PI)(BioLegend)；异氟烷(河北一品制药有限公司)；其余试剂均为国产分析纯。

2方法

2.1矽肺模型的制备60只雄性C57BL/6小鼠，随机分为生理盐水组(NS组)、SiO2组、生理盐水干预组(SiO2+NS组)和螺内酯干预组(SiO2+SPI组)，每组均为15只。NS组小鼠制备模型是吸入40 μL生理盐水，其余3组小鼠吸入等容积SiO2悬浊液(50 mg/mL)。吸入的方法采用经口咽吸入，具体的方法简述如下：采用MIDMARK小动物麻醉罐2%异氟烷轻度麻醉小鼠，将小鼠上颌中切牙悬挂于特制环形架的橡胶带上，镊子夹闭鼻孔，同时从一侧嘴角轻轻拉出舌以暴露舌根和咽后壁，将均一的SiO2悬浊液或生理盐水沿咽后壁缓慢注入，确保其随呼吸运动吸入肺部，用吸耳球进行正压通气，结束后将小鼠置于掌心保持上体直立位，直至完全苏醒。模型制备后，SiO2+SPI组每天经口灌胃给予螺内酯(10 mg·kg-1·d-1)治疗，SiO2+NS组给予同等容积的生理盐水灌胃。

2.2标本的采集及处理分别于矽肺模型建立后第3、14、28天取材。将小鼠麻醉后摘眼球放血处死，固定后于颈部正中纵行切开皮肤，钝性分离皮下组织，暴露气管，将气管剪开小切口插入插管并结扎，用注射器注入1 mL预冷无菌生理盐水，轻轻按压小鼠胸廓，回吸液体，共进行3次。将收集的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)进行细胞计数、分类计数及流式细胞术分析，右下肺叶用于制备单细胞悬液，进行流式细胞术检测。

2.3肺泡灌洗液细胞分类计数将BALF 于4 ℃ 300×g离心10 min，弃去上清，用红细胞裂解液重悬细胞，再一次离心后弃去上清，用预冷的D-Hanks液重悬细胞，进行细胞计数，取1×105细胞甩片，4 ℃、1 500 r/min离心15 min进行甩片，将玻片上的细胞在预冷的无水乙醇中固定30 min，水化后进行HE染色，封片后用光学显微镜进行观察，并在400倍视野中随机选择1个区域，连续计数200个细胞，计算巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞比例，并根据细胞计数的结果得出各种细胞的绝对计数。

2.4流式细胞术检测肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AMφ)表型变化取5×105BALF细胞，加入10 μL抗体混合液(含PI 2 μL、PerCP/Cy5.5-CD64 1.2 μL和PE-CD206 1 μL)24 ℃避光孵育15 min, 加入600 μL staining buffer，300目尼龙滤网过滤至流式试管，Beckman Coulter FC500流式细胞仪进行检测。

2.5流式细胞术检测肺间质巨噬细胞(interstitial macrophages,IMφ)表型变化将新鲜的经过灌洗的右下肺置于1.5 mL Eppendorf管，在冰上用预冷的D-Hanks溶液清洗肺组织3次，用眼科剪剪碎肺组织；加入1.5 mL 0.2% I型胶原酶，1 mL移液器轻轻吹散组织团块；37 ℃、5% CO2细胞培养箱孵育1 h，每隔20 min轻轻抽吸数次；将所得细胞悬液用300目尼龙滤网过滤，4 ℃、300×g离心5 min后弃上清，加入预冷的红细胞裂解液，作用10 min后离心弃上清，D-Hanks溶液洗涤后重悬细胞并计数，取5×105细胞，加入10 μL抗体混合液(含PI 2 μL、PerCP/Cy5.5-CD64 1.2 μL、PE/Cy7-CD11b 1 μL和PE-CD206 1 μL)24 ℃避光孵育15 min, 加入600 μL staining buffer，300目尼龙滤网过滤至流式试管。

3统计学处理

STATA 14.1统计学软件进行统计分析，计量资料以均数±标准误(mean±SEM)表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析，多重比较使用Tukey’s法，以P<0.05作为差异有统计学意义。

结果

1各组小鼠肺泡灌洗液细胞分类计数变化

SiO2诱导后3 d，小鼠肺泡灌洗液中的总细胞数、中性粒细胞数、淋巴细胞和巨噬细胞计数明显增高(P<0.01)，而给予SPI干预后，BALF总细胞数、中性粒细胞数及淋巴细胞数均明显下降(P<0.05)，而巨噬细胞数未见显著下降。

SiO2诱导后14 d，小鼠肺泡灌洗液总细胞数及各类细胞分类计数均显著增高(P<0.01)，而给予SPI干预后，BALF中的总细胞数、中性粒细胞数及巨噬细胞数均显著下降(P<0.05)，而淋巴细胞计数未见显著下降。

SiO2诱导后28 d，小鼠肺泡灌洗液总细胞数及各类细胞分类计数显著增高(P<0.01)，SPI干预可以显著降低肺泡灌洗液总细胞数、巨噬细胞数及中性粒细胞数(P<0.05),见图1。

Figure 1.SPI treatment alleviated inflammatory cell infiltration induced by SiO2administration. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsNS group;#P<0.05,##P<0.01vsSiO2+SPI group.

图1螺内酯干预后小鼠肺泡灌洗液细胞总数及分类计数的变化

2各组小鼠肺炎症纤维化转化期肺泡巨噬细胞亚群变化

造模后14 d，SiO2组小鼠M1 AMφ比例显著下降，与NS组相比差异有统计学显著性(P<0.01)；而SiO2+SPI组小鼠M1 AMφ比例较SiO2+NS组明显增高，差异均有统计学显著性(P<0.01)。M2 AMφ也有相应的变化趋势。造模后28 d小鼠肺泡巨噬细胞表型存在与14 d肺泡巨噬细胞表型偏移类似的变化，具体表现为SiO2可以诱导肺泡巨噬细胞由M1表型向M2表型偏移，而SPI干预可以明显逆转上述表型偏移(P<0.01)，见图2。

3各组小鼠肺炎症纤维化转化期间质巨噬细胞亚群变化

如图3所示，在造模后的14 d和28 d，SiO2组小鼠M1 IMφ比例较NS组均明显下降，M2 IMφ比例升高(P<0.01)。给予SPI干预小鼠M1 IMφ比例明显升高，相反M2 IMφ比例下降，差异均有统计学显著性(P<0.01)。

Figure 2.SPI treatment reversed alveolar macrophage (AMφ) subtype switching induced by SiO2administration. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsNS group;##P<0.01vsSiO2+SPI group.

图2螺内酯干预后小鼠肺泡巨噬细胞表型的变化

Figure 3.SPI treatment reversed pulmonary interstitial macrophage (IMφ) subtype switching induced by SiO2administration. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsNS group;##P<0.01vsSiO2+SPI group.

图3螺内酯干预后小鼠肺间质巨噬细胞表型变化

讨论

矽肺是尘肺病中最常见、危害性最大的一种。现阶段对矽肺的治疗仍停留在氧疗、肺泡灌洗及肺移植等对症治疗阶段。近年来，国内外学者从免疫调节及细胞因子水平对矽肺的发病机制进行了探索，然而其确切的机制尚未完全阐明。近来的研究表明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在肺损伤的发生发展过程中起着重要的作用[11]。近来的研究证明针对该系统的干预可以在博来霉素导致的肺损伤模型中发挥明显的治疗作用[12]，多项研究使用盐皮质受体阻断剂SPI治疗博来霉素导致的肺纤维化，效果良好。SPI能否治疗石英导致的肺损伤及肺纤维化鲜见于文献报道，有待进一步的研究。

巨噬细胞是广泛存在于呼吸系统的主要免疫防御细胞，是机体呼吸系统抵御病原体第一道防线的重要组成部分[13]，按照存在的部位，巨噬细胞可以分为存在于肺泡和呼吸道的肺泡巨噬细胞及存在于肺间质的间质巨噬细胞，两者均在矽肺发生发展过程中起着重要的作用。一般的观点认为，M1表型巨噬细胞具有促炎、抵抗病原体的作用，而M2表型巨噬细胞具有组织重塑、促纤维化的作用[14]。Herd等[15]的研究表明巨噬细胞对SiO2颗粒的吞噬反应与其表型有关：M1表型巨噬细胞与M2表型及未极化的巨噬细胞相比对入侵的SiO2颗粒有更强的吞噬作用，因而在矽肺的发生发展中表现为保护作用，而M2表型则表现为促纤维化的作用，因此调控巨噬细胞表型可能是治疗矽肺的有效靶点[15]。MR广泛分布于包括巨噬细胞在内的多个器官系统[7-9]，本课题组已经使用MR阻断剂SPI调控肺部巨噬细胞表型，治疗BLM导致的肺损伤及纤维化[10]，因此我们假设SiO2可以诱导小鼠肺巨噬细胞发生表型偏移，而SPI可以逆转SiO2诱导的巨噬细胞表型偏移。

本研究发现，在SiO2干预后第3天及第14天，小鼠BALF中的细胞总数及中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞显著增高，在造模后第3天，SPI显著降低了BALF总细胞数、中性粒细胞数及淋巴细胞数，在造模后第14天，SPI显著减低了BALF总细胞数、中性粒细胞数及巨噬细胞数，表明SPI显著减轻了SiO2导致的炎症细胞渗出。同时，检测SiO2诱导后14 d、28 d肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞亚型发现，SiO2组有保护作用的M1表型巨噬细胞比例明显下降，向具有促纤维化作用的M2表型偏移，与Herd等[15]的研究一致。而SiO2+SPI组M1表型的比例显著提高，M2表型比例相应下降，与SiO2组及SiO2+NS组相比差异有统计学显著性。由此可见，结果验证了本研究的假设：SiO2可以诱导小鼠巨噬细胞表型由M1向M2表型偏移，SPI可以逆转巨噬细胞表型的偏移，并减轻小鼠肺泡炎症细胞的渗出，可能是SPI减轻矽肺小鼠炎症和纤维化的潜在机制，有待于进一步的研究。

综上所述，SPI治疗可以在一定程度上提高具有保护作用的M1表型巨噬细胞的比例，从而减轻矽肺早期的炎症细胞浸润。下一步的研究拟进一步研究SPI通过调控巨噬细胞表型治疗矽肺的具体分子生物学机制。

[参考文献]

[1]Huaux F. New developments in the understanding of immunology in silicosis[J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2007, 7(2):168-173.

[2]Gerber A, Klingelhoefer D, Groneberg DA, et al. Silicosis: geographic changes in research: an analysis employing density-equalizing mapping[J]. J Occup Med Toxicol, 2014, 9:2.

[3]Cassel SL, Eisenbarth SC, Iyer SS, et al. The Nalp3 inflammasome is essential for the development of silicosis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(26): 9035-9040.

[4]Mills CD. Anatomy of a discovery: M1 and M2 macrophages[J]. Front Immunol, 2015, 6:212.

[5]Pan B, Liu G, Jiang Z, et al. Regulation of renal fibrosis by macrophage polarization[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 35(3):1062-1069.

[6]Boorsma CE, Draijer C, Melgert BN. Macrophage heterogeneity in respiratory diseases[J]. Mediators Inflamm, 2013, 2013:769214.

[7]Gomez-Sanchez E, Gomez-Sanchez CE. The multifaceted mineralocorticoid receptor[J]. Compr Physiol, 2014, 4(3):965-994.

[8]Gomez-Sanchez EP. Brain mineralocorticoid receptors in cognition and cardiovascular homeostasis[J]. Steroids, 2014, 91:20-31.

[9]McCurley A, Jaffe IZ. Mineralocorticoid receptors in vascular function and disease[J]. Mol Cell Endocrinol, 2012, 350(2):256-265.

[10]Ji WJ, Ma YQ, Zhou X, et al. Spironolactone attenuates bleomycin-induced pulmonary injury partially via modulating mononuclear phagocyte phenotype switching in circulating and alveolar compartments[J]. PLoS One, 2013, 8(11): e81090.

[11]Kuba K, Imai Y, Rao S, et al. A crucial role of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) in SARS coronavirus-induced lung injury[J]. Nat Med, 2005, 11(8): 875-879.

[12]Li P, Xiao HD, Xu J, et al. Angiotensin-converting enzyme N-terminal inactivation alleviates bleomycin-induced lung injury[J]. Am J Pathol, 2010, 177(3):1113-1121.

[13]Kopf M, Schneider C, Nobs SP. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells[J]. Nat Immunol, 2015, 16(1):36-44.

[14]Murray PJ, Wynn TA. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets[J]. Nat Rev Immunol, 2011, 11(11):723-737.

[15]Herd HL, Bartlett KT, Gustafson JA, et al. Macrophage silica nanoparticle response is phenotypically dependent[J]. Biomaterials, 2015, 53:574-582.

(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Regulatory effects of spirolactone on SiO2-induced lung macrophage subtype switching

SU Cheng-cheng1, ZHANG Yi-dan3, XIANG Guo-an1, MA Yong-qiang2, ZHOU Xin2, PENG Shou-chun1, WEI Lu-qing1, JI Wen-jie1

(1DepartmentofRespiralogyandCriticalCareMedicine,PingjinHospital,LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,2TianjinKeyLaboratoryofCardiovascularRemodelingandTargetOrganInjury,Tianjin300162,China;3FujianArmedPoliceCorpsHospital，Fuzhou350000,China.E-mail:ji_wenjie@hotmail.com;wei_luqing@hotmail.com)

[KEY WORDS]Silicon dioxide; Mineralocorticoid receptors; Spirolactone; Macrophages

[ABSTRACT]AIM: To investigate the influence of spirolactone (SPI) on mouse pulmonary macrophage subtype switching induced by silicon dioxide (SiO2). METHODS: C57BL/6 mice were divided into normal saline (NS) group, SiO2group, SiO2+SPI group and SiO2+NS group. A mouse model of silicosis was developed with crystalline SiO2particles (40 mg/kg, via oropharyngeal instillation). SPI (20 mg/kg) or (NS) was delivered daily by oral gavage after SiO2administration. The mice were sacrificed on days 3, 14 and 28. Alveolar washing, total cell counting, differential cell counting and flow cytometry analysis were performed. The right lower lobe of lavaged lungs was collected to prepare single-cell suspension for flow cytometry analysis. RESULTS: Compared with SiO2group, SPI treatment significantly alleviated SiO2-induced inflammatory cell accumulation in brochoalveolar lavage fluid on day 3 and 14. Compared with NS group, the M1 alveolar macrophages and M1 pulmonary interstitial macrophages in SiO2group switched to M2 subtype dramatically, while SPI treatment reversed the switching effectively.CONCLUSION: SPI treatment alleviates SiO2-induced inflammatory cell accumulation, which may be related to reversing macrophage subtype switching.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1112- 06

[收稿日期]2016- 03- 04[修回日期] 2016- 04- 05

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81441101)；天津市自然科学基金资助项目(No. 15JCZDJC35000)；武警后勤学院附属医院种子基金资助项目(No. FYZ201510; No. FYM201538)

通讯作者△姬文婕 Tel: 022-60577283； E-mail: ji_wenjie@hotmail.com； 魏路清 Tel: 022-60578671； E-mail: wei_luqing@hotmail.com

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.025