Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的影响*

董雅洁，　高维娟，　钱　涛，　卢锴锋，　朱炎杰，　谢亚芹

(1承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000；2河北中医学院，河北 石家庄 050200；3河北省人民医院，河北 石家庄 050051)



Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的影响*

董雅洁1，高维娟2△，钱涛3，卢锴锋1，朱炎杰1，谢亚芹1

(1承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000；2河北中医学院，河北 石家庄 050200；3河北省人民医院，河北 石家庄 050051)

[摘要]目的： 观察Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的影响。方法: 取体外原代培养8 d的海马神经元，随机分为6组：正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液组、黄芪注射液溶剂(无菌去离子水)对照组、Bcl-2抑制剂组和Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖，各组均于复氧复糖后24 h进行指标检测：采用细胞免疫化学染色法观察细胞形态和caspase-3阳性细胞率，Western blotting法检测海马神经元Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表达，RT-PCR法检测海马神经元caspase-3 mRNA的表达。结果: 与正常对照组相比，模型组细胞caspase-3阳性率、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA表达均明显增强(P<0.05)；与模型组相比，黄芪注射液组Bcl-2表达明显增加，细胞caspase-3阳性率、cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA表达均明显降低(P<0.05)；而黄芪注射液溶剂对照组、Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组则无明显差异;黄芪注射液溶剂对照组Bcl-2表达较正常对照组无明显变化，而Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组显著下降(P<0.05)。结论: Bcl-2抑制剂可对抗黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的作用，黄芪注射液通过Bcl-2发挥对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的抑制作用。

[关键词]海马神经元； 黄芪注射液； Bcl-2抑制剂； 缺氧缺糖/复氧复糖； 细胞凋亡； Caspase-3

缺血再灌注损伤是制约脑缺血再灌注疗效的重要病理生理机制[1]，而细胞凋亡在其中发挥着重要的作用，其中Bcl-2是与细胞凋亡关系最密切的凋亡调控基因。现代中药制剂黄芪注射液以黄芪提取物为主要成分，是目前临床上针对性治疗缺血性脑血管病的常用药物之一。本研究室前期的实验研究证明，黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠的海马神经元凋亡有抑制作用[2]，可抑制凋亡相关基因caspase-3的表达[3]，且初步推测其抗凋亡作用与上调Bcl-2的表达有关[4]。为了进一步证实黄芪注射液是否通过提高Bcl-2的活性发挥抗凋亡作用，本实验应用黄芪注射液作用于Bcl-2抑制剂干预下的缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元，观察Bcl-2抑制剂对活化的caspase-3(cleaved caspase-3)表达的影响，进而探讨黄芪注射液对缺血再灌注脑组织海马神经元保护作用的分子机制。

材料和方法

1材料

1.1实验动物SPF级新生24 h雌雄SD大鼠，由天津市山川红实验动物科技有限公司提供，许可证号为SCXK(津)2009-001。

1.2主要试剂Bcl-2抑制剂TW-37购自Selleck；兔抗大鼠caspase-3单克隆抗体购于Santa Cruz；兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体购于Chemicon；兔抗大鼠cleaved caspase-3单克隆抗体购于CST；SP免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥公司；BCA蛋白定量试剂盒购于上海申能博彩生物科技有限公司；caspase-3引物由上海生工生物工程有限公司设计；RT-PCR试剂盒购于TaKaRa；多聚赖氨酸、DNaseⅠ和阿糖胞苷均购自Sigma；特级胎牛血清、马血清均购自HyClone；谷氨酰胺和胰蛋白酶均购于武汉华美科技有限公司；DMEM/F12培养基和B27均由Gibco生产；黄芪注射液由成都地奥九泓制药厂生产，批准文号为国药准字Z51021775；其它试剂为国产分析纯。

1.3主要仪器HERAcell 150型CO2培养箱由Heraeus生产；Leica DM IL 090-135.001型倒置显微镜由Leica生产；TDL-40B离心机购自上海安亭科学仪器制造厂；MK3全自动多功能酶标仪由芬兰雷勃公司生产；稳压稳流电泳仪(DYY-6B)由北京六一仪器厂生产；RT-PCR仪(PTC-100)由MJ Research生产。

2方法

2.1海马神经元的分离与培养取新生24 h SD大鼠，浸于冰浴的75%乙醇1 min消毒，沿颅骨中缝“工”字形剪开其头皮及颅骨，用显微眼科镊钝性分离，夹取海马组织，放入冰盒上盛有D-Hanks液的玻璃培养皿中，在解剖显微镜下，去除含有血管的软脑膜，静置后，吸去上层D-Hanks液，并加入与组织等体积的0.125%的胰蛋白酶，同时用眼科剪将海马组织剪切至1 mm×1 mm×1 mm小块，充分消化15 min后，用胰酶量10%的马血清终止消化过程。将组织块混合液移入玻璃离心管中，充分吹打离散，以1 000 r/min离心5 min，离心3次，去上清后，根据海马组织量加入适量有血清种植培养液，充分吹打，制成细胞悬液，用200目滤网过滤。在倒置显微镜(×100)下经台盼蓝计数后，接种在经多聚赖氨酸包被的培养瓶中，放入37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后将培养基全部换为无血清培养液；第4天换去一半无血清培养液，并添加全液量1%的阿糖胞苷液，以抑制神经胶质细胞的生长；于第5天将培养基全部替换成新鲜无血清培养液。以后每隔1 d把一半培养液换成新鲜无血清培养液。培养8 d后，即可用于海马神经元缺氧缺糖/复氧复糖模型的建立及指标的检测。

2.2海马神经元缺氧缺糖/复氧复糖模型的建立及实验分组取原代培养8 d的大鼠海马神经元，随机分为6组：正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液组、黄芪注射液溶剂(无菌去离子水)对照组、Bcl-2抑制剂组和Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组。正常对照组不做任何特殊处理，正常培养。其余各组均参照Bossenmeyer等[5]的方法制作模型：取无糖Earle’s液替代无血清培养基，将培养瓶置于37 ℃温箱里的缺氧装置中，快速通入高纯N25 min后，再调节分压至1.5 kPa，继续缓慢、匀速、连续通入。缺氧缺糖30 min后，换正常无血清培养液，继续在37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。黄芪注射液组于缺氧缺糖的同时加入终浓度为0.5 g/L的黄芪注射液，直至细胞培养结束；黄芪注射液溶剂对照组处理方法与黄芪注射液组相同，只是将黄芪注射液换为等量的pH 7.4的无菌去离子水；Bcl-2抑制剂组于缺氧缺糖前5 min加入终浓度为400 nmol/L Bcl-2抑制剂TW-37直至细胞培养结束。Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组处理方法与黄芪注射液组相同，但也要于缺氧缺糖前5 min加入Bcl-2抑制剂，直至细胞培养结束。各组均于复氧复糖后24 h分别观察神经元形态学、细胞caspase-3阳性率、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达及caspase-3 mRNA表达。

2.3细胞免疫化学染色法检测海马神经元caspase-3蛋白的表达取经冷丙酮固定的海马神经元，采用免疫组化SP法检测caspase-3蛋白的表达，具体操作按照试剂盒说明书进行。兔抗大鼠caspase-3单克隆抗体按1∶100稀释，PBS替代 I 抗作阴性对照。阳性细胞胞浆及突起呈棕黄色颗粒状染色。对免疫组化阳性结果采用MiVnt图像分析系统进行半定量分析。

2.4Western blotting 法检测海马神经元Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表达 收集神经细胞，提取胞浆蛋白，采用BCA法进行蛋白质浓度定量测定。取30 μg样品蛋白，按4∶1的比例将蛋白样品与loading buffer(5×)混匀，95 ℃加热10 min使蛋白质变性，以12% SDS-PAGE分离蛋白，分离的蛋白用半干电转移法转移到已用甲醇激活的PVDF膜上，浸入5% milk-TBST封闭液中封闭2 h，加入兔抗大鼠 Bcl-2多克隆抗体(1∶1 500稀释)和兔抗大鼠cleaved caspase-3单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的 II 抗(1∶5 000稀释)，室温孵育60 min。洗膜后用ECL化学发光检测法显影、定影。胶片扫描后，用Quantity One 软件对显影条带进行定量分析，分别计算Bcl-2、cleaved caspase-3条带与β-actin条带的灰度比值，作为蛋白的相对表达水平。

2.5RT-PCR法检测海马神经元caspase-3的mRNA表达收集神经细胞，采用TRIzol一步法抽提总RNA，按TaKaRa RNA PCR kit (AMV)说明逆转录为cDNA。Caspase-3上游引物序列5′-ACTGGACTGTGGCATTGAG-3′，下游引物序列5′-GAAACAATACATGGAATCTG-3′，扩增片段长度为300 bp。内参照β-actin上游引物序列5′-CATCCTGCGTCTGGACCT-3′，下游引物序列5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′，扩增片段长度为480 bp。扩增条件为95 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s,53 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s，循环30次;最后72 ℃ 3 min。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，紫外透射仪观察采集图像。用Quantity One凝胶分析软件进行半定量分析，计算caspase-3条带与β-actin条带的灰度比值，作为二者mRNA的相对表达水平。

3统计学处理

采用SPSS 12.0统计分析程序对实验结果进行统计学处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异显著性用方差分析法检验，组间两两比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学显著性。

结果

1Bcl-2抑制剂对大鼠海马神经元形态学变化的影响

免疫组织化学染色结果显示：与正常对照组相比，模型组大鼠海马神经元胞核固缩，胞浆大量黄染，胞核内有少许黄色颗粒，细胞caspase-3阳性率比正常对照组表达明显增多(P<0.05)；与模型组相比，黄芪注射液组大鼠海马神经元仅有轻微的核皱缩，神经元caspase-3阳性率明显降低(P<0.05)，而黄芪注射液溶剂对照组、Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组则无明显差异，见图1。

2Bcl-2抑制剂对大鼠海马神经元Bcl-2蛋白表达的影响

Western blotting结果显示：与正常对照组相比，模型组海马神经元Bcl-2蛋白的平均灰度值明显升高(P<0.05)；与模型组相比，黄芪注射液组Bcl-2蛋白的平均灰度值明显增高(P<0.05)，Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组则明显降低(P<0.05)，而黄芪注射液溶剂对照组无明显差别，见图2。

Figure 1.The effects of Bcl-2 inhibitor on the protein expression of cleaved caspase-3 in the rat hippocampal neurons after oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD/R) detected by immunohistochemistry (×400). Mean±SD.n=6.△P<0.05vsnormal control;*P<0.05vsOGD/R.

图1免疫细胞化学染色法检测Bcl-2抑制剂对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3蛋白表达的影响

Figure 2The effects of Bcl-2 inhibitor on the protein expression of Bcl-2 in the rat hippocampal neurons after OGD/R detected by Western blotting. Mean±SD.n=6.△P<0.05vsnormal control;#P<0.05vsOGD/R.

图2Western blotting 法检测Bcl-2抑制剂对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bcl-2蛋白表达的影响

3Bcl-2抑制剂对大鼠海马神经元cleaved caspase-3蛋白表达的影响

Western blot结果显示：与正常对照组相比，模型组海马神经元cleaved caspase-3蛋白的平均灰度值明显升高(P<0.05)；与模型组相比，黄芪注射液组海马神经元cleaved caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P<0.05)，而黄芪注射液溶剂对照组、Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组无明显差别，见图3。

4Bcl-2抑制剂对大鼠海马神经元caspase-3 mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示：与正常对照组比，模型组海马神经元caspase-3 mRNA的平均吸光度值明显增加(P<0.05)；与模型组相比，黄芪注射液组caspase-3 mRNA的平均吸光度值明显降低(P<0.05)，黄芪注射液溶剂对照、Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组组无明显差别，见图4。

Figure 3. The effects of Bcl-2 inhibitor on the protein expression of cleaved caspase-3 in the rat hippocampal neurons after OGD/R detected by Western blotting. Mean±SD.n=6.△P<0.05vsnormal control;*P<0.05vsOGD/R．

图3Western blotting 法检测Bcl-2抑制剂对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元cleaved caspase-3蛋白表达的影响

Figure 4.The effects of Bcl-2 inhibitor on the mRNA expression of caspase-3 in the rat hippocampal neurons after OGD/R detected by RT-PCR. Mean±SD.n=6.△P<0.05vsnormal control;*P<0.05vsOGD/R.

图4RT-PCR法检测Bcl-2抑制剂对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3 mRNA表达的影响

讨论

神经元凋亡是脑缺血再灌注后细胞死亡的重要形式，线粒体通路在细胞存亡机制中起着至关重要的作用。本课题组前期研究证实，缺氧缺糖/复氧复糖可通过激活JNK3信号转导通路而诱发神经元凋亡[6]。而在众多的凋亡调控基因及其蛋白中，位于JNK信号通路的下游的Bcl-2和caspase-3与细胞凋亡密切相关[7-8]。

Bcl-2是Bcl-2家族中第一个被确认的能对抗细胞凋亡的蛋白，分布于线粒体外膜、核膜和内质网膜上，位于线粒体上游，通过操控线粒体膜间隙蛋白的释放对细胞凋亡加以调控[9]。Caspase-3是凋亡信号转导下游的执行者，是哺乳动物凋亡机制中的关键因素，分布于胞质中，初始无活性，当收到凋亡信号刺激被激活后，转变为cleaved caspase-3，便可大范围地水解细胞内的靶物质，从而降解细胞内蛋白，因此被认为是凋亡级联反应中最关键的效应蛋白酶[10-11]。过表达的Bcl-2蛋白可与Bax形成异源二聚体，抑制Bax的转位及二聚体化，关闭PT孔道，通过阻断细胞色素C的释放，抑制下游caspase-3的激活，而有效地抑制细胞凋亡的发生[12-13]。

作为补益类中药，黄芪具有补气固表、利尿退肿、解毒生肌的功效。现代药理学研究表明，黄芪能显著地提高缺血性脑组织中的超氧化物歧化酶含量，清除氧自由基，增加微循环灌注，以保护脑缺血/再灌注损伤的作用[14]。黄芪注射液是临床上治疗缺血性脑损伤的常用药物，可有效地抑制细胞凋亡的发生[15]，其对体外培养的缺氧缺糖/复氧复糖大鼠原代海马神经元具有明显的保护作用，可有效抑制大鼠海马神经元的凋亡，显著提高细胞的活性[2, 6]。

本研究结果显示，模型组海马神经元内Bcl-2及cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA的表达均显著高于正常组，而与模型组比，黄芪注射液组Bcl-2的表达显著增加，而cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA的表达则显著降低。分析原因可能是海马神经元在缺氧缺糖/复氧复糖的条件下细胞凋亡信号开始启动，Bcl-2的表达随之升高，抑制细胞凋亡，但随着Bax表达的进一步增多，导致Bcl-2/Bax比值下降，Bax/Bax同源二聚体增多，PT孔道开放，促使细胞色素C与Apaf-1结合增多，进而活化caspase-3，进一步诱导细胞凋亡[4]，而黄芪注射液可显著提高Bcl-2的表达发挥抗凋亡作用。且本实验观察到Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组Bcl-2的表达较模型组明显降低，但cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA的表达却与之无显著差异，则提示Bcl-2抑制剂可对抗黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元cleaved caspase-3的表达，由此推测Bcl-2可能是黄芪注射液发挥对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡抑制作用的靶点之一，这为缺血性脑血管病的靶向治疗提供理论依据。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Influence of Bcl-2 inhibitor on Astragalus injection-reduced expression of caspase-3 in rat hippocampal neurons with oxygen-glucose deprivation and reoxygenation

DONG Ya-jie1, GAO Wei-juan2, QIAN Tao3, LU Kai-feng1, ZHU Yan-jie1, XIE Ya-qin1

(1DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2HebeiUniversityofChineseMedicine,Shijiazhuang050200,China;3HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China.E-mail:gwj6088@163.com)

[KEY WORDS]Hippocampal neurons;Astragalusinjection; Bcl-2 inhibitor; Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation; Apoptosis; Caspase-3

[ABSTRACT]AIM: To observe the influence of Bcl-2 inhibitor on the expression of caspase-3 reduced byAstra-galusinjection in rat hippocampal neurons with oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD/R). METHODS: The primary rat hippocampal neurons culturedinvitrofor 8 d were chosen and randomly divided into 6 groups: normal control group, model group (OGD/R group),Astragalusinjection group,Astragalusinjection solvent (sterile deionized water)group, Bcl-2 inhibitor group and Bcl-2 inhibitor withAstragalusinjection group. The cells in all groups were tested 24 h after they were treated with reoxygenation after deprived of oxygen and glucose for 30 min except normal control group. The cell type and rate of positive cells were observed by immunohistochemistry. The protein levels of Bcl-2 and cleaved caspase-3 in the hippocampal neurons were measured by Western blotting. The mRNA expression of caspase-3 was detected by RT-PCR. RESULTS: Compared with normal control group, the caspase-3 positive rate of the cells, the protein levels of Bcl-2 and cleaved caspase-3, and the mRNA expression of caspase-3 in model group enhanced significantly (P<0.05). Compared with model group, the expression of Bcl-2 inAstragalusinjection group obviously enhanced, while the caspase-3 positive rate of the cells, the protein level of cleaved caspase-3 and the mRNA expression of caspase-3 in theAstragalusinjection group decreased significantly (P<0.05). No significant difference in injection solvent group, Bcl-2 inhibitor group and Bcl-2 inhibitor withAstragalusinjection group was observed (P>0.05). The expression of Bcl-2 was decreased sharply in Bcl-2 inhibitor group and Bcl-2 inhibitor withAstragalusinjection group. CONCLUSION: Bcl-2 inhibitor antagonizes the inhibitory effect ofAstragalusinjection on caspase-3 expression in rat hippocamal neurons with OGD/R, which may be one of the possible target for the inhibitory action ofAstragalusinjection on the apoptosis of rat hippocampal neurons induced by OGD/R.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1051- 06

[收稿日期]2015- 07- 02[修回日期] 2016- 04- 21

*[基金项目]河北省科技支撑计划(No. 13272504D)；河北省普通高等学校高层次人才科学研究计划(No. GCC2014031)；河北省教育厅青年基金项目(No. Q2012002)；河北省高校重点学科(病理学与病理生理学)资助项目(冀教高[2013]4号)

通讯作者△Tel: 0311-89926007; E-mail: gwj6088@163.com

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2016.06.015