丁苯酞对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化及主动脉壁VCAM-1表达的影响

郜　娜，　杨庆宇,　刘秀梅

(1郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院药学部，2郑州人民医院药学部， 河南 郑州 450000)



丁苯酞对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化及主动脉壁VCAM-1表达的影响

郜娜1△，杨庆宇2,刘秀梅2

(1郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院药学部，2郑州人民医院药学部， 河南 郑州 450000)

[摘要]目的： 观察丁苯酞对ApoE-/-小鼠主动脉粥样斑块形成及血管细胞黏附分子(VCAM)-1表达影响，以探讨其抗动脉粥样硬化的可能机制，为其临床应用提供理论依据和指导意义。方法: 90只6周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为3组，高脂饲喂建立动脉粥样硬化模型，同时灌胃给予丁苯酞100及200 mg·kg-1·d-1进行干预，模型组给予等量生理盐水灌胃。30只同龄雄性野生型C57BL/6J小鼠给予普通饲料喂养作为正常对照组。各组在18周龄及30周龄时分别处死15只动物。实验过程中记录各组小鼠体重变化及进食进水量。采用全自动生化仪检测18周龄及30周龄各组小鼠血脂水平；ELISA法检测血清ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量；取主动脉根部石蜡包埋切片行HE染色进行病理学检查，计算斑块相对面积；取胸主动脉进行real-time PCR检测VCAM-1的mRNA含量，同时用Western blot法检测VCAM-1的蛋白水平。结果: 与对照组相比，模型组小鼠18周龄及30周龄时体重、血脂及炎症因子均显著升高，且均发生动脉粥样硬化斑块，且VCAM-1的mRNA及蛋白表达显著增加；丁苯酞对模型小鼠体重及进食进水量无影响；但丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1剂量组血脂水平显著降低；血清ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量亦显著减少；主动脉根部粥样斑块面积显著减小；胸主动脉VCAM-1 的mRNA水平及蛋白表达均显著下调。结论: 丁苯酞可延缓高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生，其机制与其同时降低血脂及抑制炎症的发生，进而降低主动脉VCAM-1有关。

[关键词]丁苯酞；ApoE-/-小鼠； 动脉粥样硬化； 血管细胞黏附分子-1

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是严重威胁人类健康的慢性炎性疾病之一，诸多细胞及分子通路介导血管炎症因子的产生[1]。经研究显示，在AS发生机制中血管内皮细胞过度表达血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhension molecular-1，VCAM-1)是其主要危险因素[2-3]。在相关临床报道中，发现在不稳定型心绞痛、急性心肌梗死以及脑中风病人血清中游离VCAM-1明显高于对照组，并随着病情的缓解而逐渐下降。因此，VCAM-1作为内皮功能障碍的标志，与C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)及TNF-α等炎症因子也具有紧密联系，可共同预测心血管事件的发生[4-6]。药物干预降低血管内皮细胞过度表达成为近几年预防及治疗心脑血管疾病热点。丁苯酞(butylphthalide，BP)最初是由芹菜籽中提取，后经实验室合成，并于2002年被CFDA批准用于临床中风患者的治疗，其可通过减少氧化应激、改善线粒体功能、抑制血栓素A2的合成及阻止炎症的发生等机制，达到解除微血管痉挛、抑制血小板聚集、保护脑细胞等作用[7]。此外，动物实验证明丁苯酞可减少动物脑细胞淀粉样变，继而减少阿尔兹海默症的发生。但丁苯酞对于动脉粥样硬化病理发展以及内皮细胞中VCAM-1表达的影响报道甚少。本实验通过高脂饮食诱导载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-knockout，ApoE-/-)小鼠建立AS模型，给予丁苯酞进行干预，观察主动脉中VCAM-1的mRNA及蛋白表达变化，探讨丁苯酞抗AS的作用机制。

材料和方法

1实验动物、试剂和仪器

90只6周龄雄性ApoE-/-小鼠(品系C57BL/6J)，30只同龄雄性C57BL/6J野生型小鼠，均购自北京大学实验动物中心，合格证编号为SCXK(京)2011-0012。丁苯酞软胶囊由石药集团恩必普药业有限公司馈赠；氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)、CRP、TNF-α及IL-6 ELISA试剂盒均购自R&D；VCAM-1抗体及 II 抗均购自CST；SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；TRIzol、反转录试剂盒和SYBR Green荧光试剂盒均购自TaKaRa；低温离心机(Thermo)；切片机(Leica)；光学显微镜(Olympus)；蛋白电泳及显影系统(Bio-Rad)。

2实验方法

2.1动物分组、模型复制及给药90只雄性ApoE-/-小鼠随机分为模型组及丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1组，每组30只，适应性喂养1周后，给予高脂饲料[含1.25%胆固醇、22.62%蛋白质、44.13%碳水化合物及20.06%油脂(豆油2.79%，可可脂17.27%)]复制动脉粥样硬化模型，造模开始同时灌胃给予丁苯酞100 mg·kg-1·d-1及200 mg·kg-1·d-1进行干预。30只C57BL/6J作为正常对照组，给予维持饲料饮食。各组小鼠饲养于清洁级环境中，自由饮食饮水，维持12 h/12 h明暗交替，温度(25±1) ℃，湿度55%～65%。实验过程中，每周监测动物体重及进食进水量。在高脂饲喂(即给药干预)12周及24周分别处死各组15只小鼠。实验结束前禁食不禁水12 h，摘取眼球取血，4 ℃静置30 min后，1 500 r/min离心15 min，取血清，-20 ℃保存待用。分离主动脉弓固定于4%甲醛，胸主动脉置于-80 ℃冰箱中保存待用。

2.2血清学指标的测定全自动生化仪检测血清中总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(trigly-ceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量。按照ELISA试剂盒说明书检测血清中ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量。

2.3病理学检查固定完全的主动脉根部进行常规石蜡包埋，连续切片，片厚为4 μm。切片依次经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，酸水及氨水中分色，伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。Image-Pro Plus 6.0 形态计量学测算斑块面积及血管内外膜长度，回归标准圆形后计算斑块面积与血管管腔面积相对比值。

2.4RNA的提取和逆转录反应采用TRIzol两步法抽提主动脉的总RNA，按照TaKaRa的反转录试剂盒要求反转录提取总RNA，10 μL 反应体系如下: RNA 1 μg，5× PrimeScript buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Prime (50 μmol/L) 0.5 μL，Random 6-mers (100 μmol/L) 0.5 μL，去RNA酶水4.5 μL。 反应条件为42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，最后得到的cDNA，-20 ℃保存备用。

2.5Real-time PCR检测主动脉血管中VCAM-1的mRNA 表达采用实时荧光定量PCR 检测VCAM-1的mRNA 表达，内参照为GAPDH，由大连宝生物设计引物序列。VCAM-1的上游引物为5’-ATTTTCTGGGGCAGGAAGTT-3’，下游引物为5’-ACGTCAGAACAACCGAATCC-3’；GAPDH 的上游引物为5’-AACTGCTTAGCACCCCTGGC-3’，下游引物为5’-ATGACCTTGCCCACACAGCCTT-3’。PCR反应体系为SYBR Prime Ex Taq (Tli RNaseH Plus) 10 μL，PCR上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，PCR下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，DNA 模板2 μL，dH2O 6.8 μL，按2-ΔΔCt法计算mRNA含量。

2.6Western blot法检测主动脉血管中VCAM-1的蛋白表达胸主动脉约25 mg在0.5 mL蛋白裂解液中匀浆3次，每次间隔30 s，匀浆液4 ℃ 3 000×g离心15 min，收集上清，4 ℃ 12 000×g离心15 min，再次收集上清为总蛋白。蛋白浓度通过Bradford法检测，计算各样本中蛋白浓度。蛋白样品经上样缓冲液处理后，先进行5%～15% SDS-PAGE，160 V电泳后，4 ℃、100 V电泳转膜2 h。转移膜经5%、以TBST稀释的脱脂奶粉室温封闭2 h； I 抗(以TBST 1∶1 000稀释)4 ℃过夜，用TBST振荡冲洗3遍；II 抗(以TBST 1∶2 000稀释)室温作用2 h，用TBST振荡冲洗3遍。转移膜最后用ECL试剂盒显色，凝胶成像仪拍照，Quantity One软件分析。

3统计学处理

计量资料以均数±标准误(mean±SEM)表示，所有统计分析均使用SPSS 13.0 统计软件处理。组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结果

1丁苯酞对模型小鼠体重及进食量的影响

各组小鼠体重变化及进食量情况如表1所示，与对照组相比，模型组小鼠在18周龄和30周龄时，体重均显著高于平行对照组。灌胃给予丁苯酞100及200 mg·kg-1·d-1干预，小鼠体重与模型组相比无显著差异。各组小鼠进食量在实验过程中无明显差异。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2丁苯酞对模型小鼠血脂水平的影响

各组小鼠血脂水平如表2所示，与对照组相比，模型组小鼠血清在18周龄和30周龄时TC、TG及LDL-C均显著升高，HDL-C水平显著下降，且30周龄后小鼠血脂变化较18周龄更显著。造模之初即给予丁苯酞进行干预至18周龄和30周龄，可见100及200 mg·kg-1·d-1剂量组小鼠血清中TC、TG及LDL-C水平较模型组显著降低，HDL-C含量显著升高。且丁苯酞对模型小鼠血脂干预作用呈现一定剂量依赖性。

3丁苯酞对小鼠血清炎症因子水平的影响

与对照组相比，模型组小鼠在18周龄和30周龄时血清中ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量均显著增加，灌胃给予丁苯酞治疗至18周龄和30周龄可剂量依赖性地降低模型小鼠血清升高的ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量，见表3。

4丁苯酞对模型小鼠主动脉粥样硬化斑块病理发展的影响

如图1所示，对照组小鼠即野生型C57BL/6J小鼠在平行饲养至18周龄和30周龄时均可见主动脉壁薄厚均匀，内膜完整，内壁光滑无动脉粥样硬化斑块形成；模型组ApoE-/-小鼠高脂饲喂至18周龄的情况下可见主动脉内膜明显增厚，内壁不光滑，局部可见明显动脉粥样硬化斑块，呈现向管腔发展的占位性病变，高脂饲喂至30周龄，主动脉根部动脉粥样硬化情况更严重；造模的同时给予丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1进行干预，至18周龄和30周龄时与平行模型组相比，均可见斑块面积及病变程度均显著减轻，且具有剂量依赖性。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.05,##P<0.01vsmodel.

Figure 1. Observation of aortas in each group (HE staining, ×200).

图1各组小鼠主动脉图

各组小鼠主动脉粥样硬化斑块定量分析结果可见，模型组显著高于对照组，丁苯酞低、高剂量组与模型组相比，粥样硬化斑块面积/动脉总面积显著降低，见图2。

5丁苯酞对模型小鼠主动脉VCAM-1 mRNA表达的影响

在18周龄和30周龄时，模型组小鼠主动脉VCAM-1的mRNA表达显著高于平行对照组小鼠，灌胃给予丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1在18周龄和30周龄时后均可显著降低模型小鼠主动脉中上调的VCAM-1的mRNA表达，并呈一定剂量依赖性。

Figure 2. Comparison of plaque area/lumen area in each group. Mean±SEM.n=15.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

图2各组小鼠斑块面积与管腔面积比值的比较

Figure 3. The mRNA level of VCAM-1 in the aortas of each group. Mean±SEM.n=15.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

图 3各组小鼠主动脉中VCAM-1 mRNA水平

6丁苯酞对模型小鼠主动脉VCAM-1蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组小鼠主动脉VCAM-1蛋白表达均显著升高；丁苯酞可剂量依赖性地降低模型小鼠主动脉中VCAM-1蛋白的表达，见图4。

Figure 4. The protein level of VCAM-1 in the aortas of each group. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

图 4各组小鼠主动脉中VCAM-1蛋白水平

讨论

AS是一种累及全身大、中动脉内膜的慢性炎症性疾病，脂质代谢异常和炎症反应是AS发生和发展的主要危险因素，目前学术界认可度较高的AS发病机制是Virchow的动脉粥样硬化脂质浸润学说[8]和经Ross完善的炎症学说[1]。在高血脂等致炎因子的作用下，VCAM-1及ICAM-1等在介导单核细胞与血管内皮细胞黏附及其相互作用方面起到了关键作用，活化的黏附分子与单核细胞表面受体结合，促使单核细胞黏附到损伤的内皮上，因此这些黏附分子的激活与否影响着AS病变的形成与发展。VCAM-1是一种介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间黏附及相互作用的膜表面糖蛋白，在内皮细胞、白细胞、血小板及平滑肌细胞表面表达。研究表明应用药理途径降低动脉粥样硬化相关细胞黏附分子的表达或功能可阻抑或减慢AS发生[9]。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族，可表达于白细胞、成纤维细胞、上皮细胞，尤其在血管内皮细胞中的表达最强。VCAM-1和ICAM-1在抗原表达过程中可以作为淋巴细胞的共刺激信号，在AS中进一步发挥作用。

对于VCAM-1及ICAM-1的激活的具体机制，有研究表明，高胆固醇血症发生时，体内抗氧化因子活性降低，氧自由基生成增多，LDL经氧自由基修饰形成ox-LDL，其可激活血管内皮细胞NF-κB及TNF-α，诱导或上调VCAM-1。另有研究证实，CRP可刺激单核细胞释放炎症介质IL-6和TNF-α诱发血管炎症，且通过加重血管内皮损伤，促进平滑肌细胞增殖与迁移，上调VCAM-1的表达，激活补体系统，促进血栓形成，参与AS的形成及发展。

本实验研究中选用的ApoE-/-小鼠，是目前公认的进行药物抗动脉粥样硬化活性筛选及作用机制的最经典的动物模型之一[10]，而C57BL/6J小鼠与其具有相同的遗传背景，在研究中常作为正常对照组。ApoE-/-小鼠在正常饮食及高脂饮食情况下血脂均会升高，且其发病机制与人类动脉粥样硬化形成过程相似。已有研究报告，ApoE-/-小鼠在5～6周龄时主要是单核细胞趋附于损伤的内皮细胞处，8～10周龄出现脂纹，15～20周龄后逐渐出现纤维斑块，病变部位以主动脉根最为明显，其次为胸主动脉[11]。本实验中持续给予ApoE-/-小鼠高脂饲喂12周即18周龄，可见模型组小鼠血脂水平显著升高，并且主动脉发生动脉粥样硬化斑块沉积。且血清中炎症因子CRP、TNF-α及IL-6高表达。根据以上论述内容，高血脂及升高的炎症因子水平会诱导黏附因子VCAM-1的高表达，本实验结果从蛋白及mRNA水平均证实了这一点，但值得注意的是30周龄时模型组血脂和炎症因子水平高于18周龄小鼠，动脉粥样硬化情况亦较为严重，但30周龄模型组小鼠胸主动脉中VCAM-1 mRNA及蛋白水平确低于18周龄小鼠，可以看出VCAM-1是动脉粥样硬化发生早期一个重要的致病因素。造模初期即给予丁苯酞持续干预12周及24周后，可见血脂及炎症因子均剂量依赖性地降低，VCAM-1的蛋白和mRNA水平均显著下降，可见丁苯酞是同时通过降低血脂及减少炎症因子，进而降低VCAM-1在主动脉中的表达，抑制或延缓AS的发生。

[参考文献]

[1]Conti P, Shaik-Dasthagirisaeb Y. Atherosclerosis: a chronic inflammatory disease mediated by mast cells[J]. Cent Eur J Immunol, 2015，40(3):380-386.

[2]Park JG, Ryu SY, Jung IH, et al. Evaluation of VCAM-1 antibodies as therapeutic agent for atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Atherosclerosis, 2013, 226(2):356-363.

[3]梁萍，孙雷，唐建武，等. 细胞间粘附分子1、血管细胞粘附分子1和肿瘤坏死因子α在人动脉粥样硬化病灶中的表达及意义[J]. 中国动脉硬化杂志, 2004, 12(4):427-429.

[4]Valgimigli M, Merli E, Malagutti P, et al. Hydroxyl radical generation，levels of TNF-α，and progression to heart failure after acute myocardial infarction[J]. J Am Coll Cardiol, 2004, 43(11):2000-2008.

[5]Gao B, Li L, Zhu P, et al. Chronic administration of methamphetamine promotes atherosclerosis formation inApoE-/-knockout mice fed normal diet[J]. Atherosclerosis, 2015, 243(1):268-277.

[6]Bermadez EA, Rifai N, Buring J, et al. Interrelation-ships among in circulating interleukin-6, C-reactive protein, and traditional cardiovascular risk factors in women[J]. Arterioscl Thromb Vasc Biol, 2002, 22(10):1668-1673.

[7]李延可，刘宁，陈江君. 丁苯酞对急性缺血性脑卒中的作用及机制研究[J].中国医药导刊, 2012, 14(2):254-255.

[8]Dargel R. The lipid infiltration theory of atherosclerosis[J]. Z Med Lab Diagn, 1989, 30(5):251-255.

[9]Ervinna N, Mita T, Yasunari E, et al. Anagliptin, a DPP-4 inhibitor, suppresses proliferation of vascular smooth muscles and monocyte inflammatory reaction and attenuates atherosclerosis in male apo E-deficient mice[J]. Endocrinology, 2013, 154(3):1260-1270.

[10]von Holt K, Lebrun S, Stinn W, et al. Progression of atherosclerosis in the Apo E-/- model: 12-month exposure to cigarette mainstream smoke combined with high-cholesterol/fat diet[J]. Atherosclerosis, 2015, 205(1):135-143.

[11]Nakashima Y, Plump AS, Raines EW, et al. ApoE-deficient mice develop lessions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree[J]. Arterioscler Thromb, 1994, 14(1):133-140.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effects of butylphthalide on atherosclerosis lesion and VCAM-1 expression in aortic wall of ApoE-/-mice

GAO Na1, YANG Qing-yu2, LIU Xiu-mei2

(1DepartmentofPharmacy,AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,HenanCancerHospital,2DepartmentofPharmacy,People’sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450000,China.E-mail:gn_submit@163.com)

[KEY WORDS]Butylphthalide;ApoE-/-mice; Atherosclerosis; Vascular cell adhesion molecular-1

[ABSTRACT]AIM: To observe the protective effects of butylphthalide on atherosclerosis lesion and vascular cell adhesion molecular-1 (VCAM-1) expression in the aortic wall ofApoE-/-mice, and to explore the possible mechanism underlying these beneficial effects.METHODS: MaleApoE-/-mice at 6 weeks of age (n=90) were randomly divided into 3 groups. ThirtyApoE-/-mice fed with high-fat diet and treated with saline simultaneously were defined as model group. ThirtyApoE-/-mice fed with high-fat diet and treated with butylphthalide (100 and 200 mg·kg-1·d-1) were defined as treatment groups. Thirty wild-type C57BL/6J mice treated with saline were defined as control group. Fifteen mice in each group were sacrificed both at the ages of 18 and 30 weeks. The body weight, food intake and water intake were monitored weekly through the experiment. The lipid profiles were determined both at 18 and 30 weeks of age. Aortic roots were stained with hematoxylin and eosin for pathological examination. Serum ox-LDL, CRP, TNF-α and IL-6 were examined by ELISA. The expression of VCAM-1 at mRNA and protein levels was determinate by real-time PCR and Western blot in the thoracic aortas. RESULTS: Compared with control group, at 18 and 30 weeks of age, the body weight, serum lipid profiles and inflammatory factors were increased, while the atherosclerotic plaques were raised. The mRNA and protein levels of VCAM-1 were up-regulated. However, serum lipid levels in butylphthalide treatment groups (both at doses of 100 and 200 mg·kg-1·d-1) were decreased significantly. Serum ox-LDL, CRP, TNF-α and IL-6 were also decreased by butylphthalide treatment. Furthermore, atherosclerotic plaque areas in the aortic roots were reduced by butylphthalide treatment. In addition, the expression of VCAM-1 at mRNA and protein levels in the thoracic aortas was down-regulated by butylphthalide treatment.CONCLUSION: Butylphthalide delays the occurrence of high-fat diet-induced atherosclerosis and down-regulates the expression of VCAM-1 in theApoE-/-mice, which may be due to its alleviative effects on hyperlipidemia and inflammation.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1037- 06

[收稿日期]2015- 06- 12[修回日期] 2016- 03- 22

通讯作者△Tel: 0371-65588134; E-mail: gn_submit@163.com

[中图分类号]R541.4; R972+.6

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.013