实验性自身免疫性重症肌无力模型构建方法进展①



实验性自身免疫性重症肌无力模型构建方法进展①

许骏尧陈以狄程杨孙佳玥朱洁吴颢昕

(南京中医药大学基础医学院，南京210046)

重症肌无力(Myasthenia gravis,MG)是在细胞免疫依赖性补体参与下，由乙酰胆碱受体抗体(Acetylcholine receptor antibody,AChR Ab)介导而产生的自身免疫系统疾病。位于神经肌肉接头(Neuromuscular junction,NMJ)处的AChR是导致MG的自身免疫抗原。其发病原因及治疗方法仍有待进一步研究探讨，所以研究实验性自身免疫性重症肌无力动物模型(Experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)十分有必要。1973年Patrick等[1]首次从电鳗电器官提取纯化AChR免疫家兔后建立了EAMG模型。随着研究深入，越来越多建模方法被应用到MG动物模型上。本文对国内外各种建模方法综述如下。

1提纯电鳐乙酰胆碱受体构建EAMG模型

1.1经典方法相比国外多从加利福尼亚电鳐电器官中提取AChR，在中国多选用较易获得的国产电鳐。Wang等[2]利用亲和层析技术从国产电鳐电器官中提纯AChR蛋白后，与弗氏完全佐剂(CFA)混合成油包水乳剂，于第1、4周分别对Lewis大鼠足垫、腹部及背部皮下进行多点注射，5周后大鼠开始出现渐进性肌无力表现。

该方法证明外源性AChR(国产电鳐AChR)可成功诱导大鼠的MG，且在发病机制、症状、电生理及免疫学改变方面与人MG十分相似，适合MG具体发病机制、评估药物有效性及治疗机制等方面的研究。因其方法相对成熟，故利用该方法进行后续研究的国内外报道也最多，但由于实验动物无法长期地稳定地产生抗体,故需多次用AChR免疫动物，因而实验周期较长，不适合短期研究。

1.2利用人免疫球蛋白转基因小鼠构建EAMG模型Lonberg等[3]在1994年建立了表达人免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)的转基因小鼠，用不同免疫原接种此种小鼠后，均可产生针对该免疫原的人源性抗体。李红花等[4]参照其方法成功构建含有人Igμ、γ1和κ胚系基因的转基因小鼠，并将由电鳐电器官提纯的AChR与CFA一起于第0、3、5周皮下注射该小鼠。3周后小鼠出现肌无力症状并产生了人抗AChR抗体，且滴度与MG患者相似。由于采用了人Ig转基因小鼠,其产生的抗体均为人源性抗体,这使得本法构建的EAMG模型在免疫学上更接近人MG。本法目前属于一种新的尝试，国内外文献较少。

2被动免疫法构建EAMG模型

2.1用MG患者血清及血清内成分建立被动转移模型高波廷等[5]收集未使用过激素治疗的AChR Ab阳性和阴性的MG患者血液，分离血清后以每次0.8 ml注射小鼠，连续7 d，并且为了避免小鼠对人血清蛋白产生免疫反应，在初次注射血清后24 h再腹腔注射环磷酰胺300 mg/kg。两组小鼠均出现肌无力症状及肌电图衰减。此外，Burges等[6]将纯化后的IgG制品注射小鼠，亦出现同样的结果。

本方法证实MG是血清内抗体介导的自身免疫性疾病，同时提示血清阴性MG发病机制与血清阳性MG不完全相同，这为进一步研究MG的发病机制奠定了基础。因其造模周期相对较短，制备成本低，较主动免疫也更便捷，故适合于如MG受体保护等短期研究。但因MG患者发病不稳定，临床常反复，且获取未用激素治疗过的MG患者血清较困难，以及不同患者具有异质性的原因，模型结果的评定及实验的标准化比较困难。

2.2通过MG患者胸腺组织移植建立被动转移模型Schönbeck等[7]将MG患者的完整胸腺组织移植到严重联合免疫缺陷小鼠肾被膜下，在小鼠血清中抗人AChR Ab可在1～2周后被检测到，到11周时AChR Ab滴度可达到典型重度肌无力水平，且骨骼肌终板处可见到AChR Ab的沉积，而注射分离的胸腺细胞，仅能检测到小鼠体内抗AChR Ab的一过性增高。

该方法证实了AChR Ab的产生与维持和胸腺组织有关，而胸腺细胞虽然参与了发病过程，但并不是唯一的致病因素，这为MG患者胸腺致敏机制的研究打下了基石。

2.3通过移植MG患者外周淋巴细胞建立被动转移模型Wang等[8]将MG患者血淋巴细胞分别腹腔注射严重联合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠，结果发现小鼠移植血淋巴细胞，或缺乏CD8+的淋巴细胞，或缺乏CD4+的淋巴细胞与MG患者抗AChR CD4+细胞构成的重组细胞后，出现了MG样症状。该方法证实了在MG的发病过程中CD4+细胞的必要性，属于研究性模型。

2.4通过向实验动物脑室中注入MG患者AChR Ab建立被动转移模型有研究表明，MG患者的病变部位不仅局限在NMJ处，还可以波及中枢神经系统，造成中枢功能障碍[9]。

李柱一等[10]将收集的MG患者血清,用硫酸氨盐析、ProteinG 和α-银环蛇毒素-AChR(α-BGT-AChR)亲和层析法提取AChR Ab后，将 AChR Ab注入大鼠侧脑室,隔日重复,共3次；2周后，大鼠除出现了与MG动物模型十分相似的症状，还出现脑干听觉传导中枢功能障碍等症状。

该方法旨在研究脑脊液中AChR Ab引起MG中枢神经系统损害的机制，而实验结果表明中枢神经系统功能障碍与AChR Ab和神经AChR结合有关，这与其他主动、被动免疫法诱导EAMG的机制不完全相同。中枢受损MG模型的建立将为进一步阐明中枢神经系统下位运动神经元引起肌无力的机制提供依据。

2.5利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体建立被动转移模型mAb35杂交瘤细胞株是Lindstrom实验室制备于上世纪80年代左右的一系列AChR单克隆抗体之一，属于IgG1,它可对多种品系AChRα亚单位主要免疫区肽段产生直接反应，同时其亦可与患者血清IgG竞争性结合小鼠AChR[11]。

在裸鼠腹腔内注射经挑选的处于对数生长期的mAb35杂交瘤细胞，一周后收集其腹水，采用硫酸铵盐法提纯IgG，透析后分装保存。并用多聚甲醛固定后的TE671细胞与提纯抗体进行免疫学鉴定。按0.25 mg/kg腹腔注射含已制备mAb35的生理盐水1 ml；免疫后48 h内动物体重明显减轻，肌力下降，活动减少，血清中可检测到AChR Ab；NMJ上AChR数量减少，突触后膜褶皱减少间隙变大，符合MG特征性病理改变[12]。此外，也有成功利用mAb A7、mAb G10等诱导EAMG的报道[13,14]。

该方法鉴于血清被动转移法存在具有异质性的不足，旨在利用单克隆抗体建立较为标准化的EAMG模型。实验结果证实，单克隆抗体可结合鼠AChR并成功诱导各项指标与人MG十分相似的EAMG模型。其建模时间短，发病率高(达100%)而易于评估，且避免了异质性，属较标准化的被动转移模型，国外多用此方法进行短期研究。

2.6利用EAMG鼠AChR Ab建立被动转移模型Lindstrom等[15]从EAMG大鼠血清中用40%(NH4)2SO4沉淀粗制Ig，并在DEAE柱上利用色谱法层析获得IgG，注射前将抗体稀释于生理盐水中，注射到大鼠颈静脉中。12 h后，大鼠即出现无力、疲劳等MG样症状。

实验结果证实MG可通过血清中抗体转移的方式在鼠之间转移。该方法造模率高，肌无力维持时间短(72 h～7d)，适合短期复制模型，但由于需要已经成功建模的EAMG鼠，故不适合首次实验。

3利用基因工程构建EAMG模型

3.1重组人AChR建立EAMG模型Lennon等[16]将人工合成的人AChRα亚基1～210片段克隆入可诱导表达的质粒载体，转染大肠杆菌，获得了融合蛋白，并将其与等体积CFA制成乳剂，于大鼠肩背足垫等处多点注射，此外,每只大鼠均额外注射B.pertussis疫苗。大鼠于1个月后均出现了症状、血清抗体滴度、电生理学及生化指标的MG样改变。Sun等[17]从TE671细胞中获取人AChRα亚基细胞外结构域(Extracellular domain,ECD)序列,嵌入质粒中，转染BL21(DE3)plysS菌株，并用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达，获取并提纯ECD蛋白，免疫大鼠，成功构建EAMG。

该方法证实AChRα亚基1～210是ACh的结合位点和主要免疫区，其表达产物具有免疫原性，可成功诱导EAMG模型。相比经典方法，本方法具有造模率较高，免疫原充足，操作简便，成本低等优点。

3.2采用核酸疫苗建立EAMG模型核酸疫苗通过将克隆靶抗原编码的基因或DNA片段加入到如质粒、噬菌体等载体中去，然后向实验动物体内注入重组后的载体，而使得机体表达靶抗原基因，从而激活机体的免疫系统，产生相应的体液和细胞免疫[18]。Niu等[19]将人AChRα亚基N端211个氨基酸(含ACh结合位点和主要免疫结构域)基因片段插入到质粒载体pcDNA3.0中，构建了重组质粒pcDNA AChRα211；免疫前三天于小鼠左右股四头肌注射0.5%布比卡因100 μl，免疫时在同部位注射含50 μg纯质粒DNA 100 μl,每隔2周加强免疫1次，共免疫3次，小鼠在免疫后均出现渐进性肌无力的表现，ELISA检测证实了特异性免疫的存在。孟和宝力高等[20]在上述实验的基础上，分别重组大鼠白介素6(Interleukin-6,IL-6)和AChRα亚基N端205个氨基酸的质粒，共同免疫大鼠,从实验结果来看，症状观察、肌电图、血清学检测、组织学检测等指标均证实,通过本方法建立MG模型是可行可靠的。

该方法利用近年来逐渐发展起来的新的免疫学技术——核酸疫苗，旨在构建能在动物体内长期表达产生免疫原的EAMG模型。该核酸疫苗不但具有较好的免疫原性，且目的基因在体内保留时间长，不断表达抗原蛋白，产生较强的持久性免疫应答[21]，对研究MG发病机理及治疗手段具有实际意义。由于本法为新技术的探索性应用，且上述研究也指出本法可能存在动物模型症状较轻的情况，故目的基因的选取、表达情况及具体操作方法仍有待进一步研究和完善。该方法属于近几年的新探索，具有广阔的前景。

3.3利用转基因小鼠NMJ局部产生的IFN-γ建立EAMG模型有研究表明：IFN-γ与重症肌无力的发病十分密切[22]。Gu等[23]，将鼠IFN-γ基因与调节性片段——鼠nAChRε基因融合，构建DNA质粒，植入小鼠卵母细胞，使新生小鼠在神经接头处表达该基因并产生IFN-γ；结果显示，约6个月后转基因小鼠出现了肌无力症状、迟缓性麻痹和肌无力症状可被ACh酯酶抑制剂暂时性缓解等与人MG十分相似的特征，电生理学测试出现肌电图振幅衰减阳性，组织学检查显示在终板处存在单核细胞浸润和抗体的沉积；此外，免疫沉淀反应分析也表明，转基因小鼠血清中之前未知的87 kD靶抗原与大多数人MG血清中的相似。该方法证实MG的发病与IFN-γ有关。

4人工合成AChR多肽构建EAMG模型

AChR由2个α、1个β、1个γ和1个δ共5个亚基组成。其中大部分肌无力动物模型和MG患者中主要致病性抗体AChR Ab所攻击的靶点位于α亚基内,其具有高度的免疫性，具有能引起MG的抗原决定簇，因此，特异性ACh反应性T细胞可以通过刺激α亚基或α亚基的某些肽段的方式而被激活，从而产生机体免疫应答反应[24]。

Lennon等[25]曾先后尝试用人工合成的电鳗AChRα亚基125～147肽段(Tα125～147)和人AChRα亚基129-145肽段(Hα129-145)构建EAMG,抗体阳性率从仅为10%提升至76%[26]。以上研究提示小分子肽可作为免疫原诱导产生抗体，构建EAMG，且同源性与阳性率正相关。Baggi等[27]在此基础上人工合成大鼠AChRα亚基97～116肽段(Rα97～116，不偶联载体蛋白)与等量CFA充分混匀制成乳剂于大鼠手足垫多点注射，30 d后加强免疫一次。大鼠于加强免疫2周后出现进行性肌无力，血清抗体阳性等，造模率达73.3%。国内亦有利用Rα97-116、Tα125-147构建EAMG的报道，造模率达75%以上[24,28]。

该方法证实人工合成的位于AChRα亚基的某些区段的同源肽段可作为免疫原诱导EAMG模型，为MG发病机制及治疗研究提供了一种较为简便的造模方法。其操作相对简洁，阳性率高，成本较低，适合批量复制，是近年国内外使用较多的方法。该模型的不足之处是：实验周期较长、因缺乏二级结构导致抗原决定簇漂移、肌无力程度较轻、临床积分低。

5针对人肌肉特异性激酶构建EAMG模型

临床上，大约有80%～90%的MG患者体内存在AChR Ab，而在剩余的患者中有40%存在肌肉特异性激酶抗体(Muscle-spedfic kinase antibody,MuSK Ab)。MuSK是存在于肌细胞膜上的一种跨膜蛋白质，对于AChR在突触后膜上的聚集起关键作用，它的缺失同样会阻碍神经肌肉信号传导，从而出现肌无力症状。

5.1主动免疫法建立EAMG模型Punga等[29]将带有His标记的大鼠MuSK-ECD(aa21～491)序列的质粒载体pCEP-PU转染HEK 293 EBNA细胞。细胞上清通过Ni-NTA超流柱后透析纯化，获得大量高表达的蛋白。每只小鼠于手足垫、尾基部及背部多点注射与CFA充分混匀的含有10 μg MuSK蛋白的乳剂，28 d后重复注射一次。小鼠于4周后开始出现MG样症状、突触后膜的改变、体重减轻，且呈进行性加重。

5.2被动转移法建立EAMG模型Cole等[30]将MuSK阳性患者血清IgG过滤消毒后，每日于小鼠腹腔注射45 mg，连续5 d以上，首次注射后24 h，需另注射环磷酰胺300 mg/kg。类似的，Klooster等[31]每日腹腔注射4 mg提纯的IgG4，7 d后小鼠出现体重下降、渐进性肌无力及肌电图衰减等。

由于MuSK Ab介导的MG的具体机制目前仍尚未明确，动物模型均处于研究阶段，且相比临床发病率更高的抗AChR MG，本类研究起步晚，也相对较少，研究水平尚待提高。不过，近几年对其机制的研究正逐渐成为MG研究领域的热点。

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[收稿2015-03-06修回2015-04-09]

(编辑倪鹏)

中图分类号R332

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0428-04

作者简介：许骏尧(1993年-)，男，主要从事自身免疫系统疾病基础方面研究，E-mail:296428835@qq.com。通讯作者及指导教师：吴颢昕(1965年-)男，博士，教授，博士生导师，主要从事心脑血管病及自身免疫系统疾病基础与临床方面研究，E-mail:wuhaoxin@souhu.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.030

①本文为2014年江苏省大学生科技创新训练计划省级重点项目(201410315003Z)。