外泌体基本生物学特性及其治疗心肌梗死的研究进展

李玲综述，石蓓审校



外泌体基本生物学特性及其治疗心肌梗死的研究进展

李玲综述，石蓓审校

摘要心肌梗死是所有心血管疾病死亡的首要原因。心肌梗死后受损心肌启动修复及心室重构的分子机制显示心肌细胞所分泌的可溶性因子在细胞局部交流及远程信息交换中发挥重要作用。目前，大量研究证实，以外泌体为主的细胞外囊泡因其运载的细胞特异性蛋白、脂质体及遗传物质在细胞及组织交流过程中扮演重要角色。本文将针对外泌体基本生物学特性的研究进行综述，并评价不同来源的外泌体治疗心肌梗死的潜能。

关键词综述；外泌体；心肌梗死

心血管疾病严重危害人类健康，心肌梗死作为缺血性心脏病的典型代表，仍然是全球致死率最高的疾病。在美国，每年有二千万人死于心血管疾病，其中，有150万罹患心肌梗死［1］。2001年Anversa课题组首先报道骨髓干细胞可以向心肌细胞分化，随即掀起干细胞向心肌细胞分化研究的浪潮，经过十余年的研究探索，多种干细胞如胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、诱导多能干细胞 （induced pluripotent stem cells，iPSCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）、心脏祖细胞（cardiac progenitor cells，CPC）及间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等已经被证明具有向心肌细胞及内皮细胞分化的潜能。然而，在心肌梗死后缺血缺氧的微环境下，干细胞介导治疗心肌梗死所面临的移植存活率低及归巢量少［2］等问题促使我们寻找新的替代方法。新近发现的外泌体（exosomes）是一种存在于细胞培养液中，由细胞分泌到胞外的囊泡状小体。被认为可作为细胞与细胞间信号传递的重要载体，参与心血管疾病病理生理过程［3］，已成为临床心脏疾病诊治研究的热点。

1 外泌体的来源及基本生物学特性

1.1 外泌体的起源及分泌

“外泌体”一词首先由Johnstone等［4］在研究网织红细胞成熟过程中囊泡的形成时提出。随后的研究发现，除网织红细胞外，外泌体还可由包括干细胞、内皮细胞、上皮细胞、树突状细胞、B淋巴细胞产生。除此之外，在多种体液如血液、尿液、精液/前列腺液、羊水和胸腔积液中也可分离提取外泌体［5］。外泌体分泌机制复杂，目前比较公认的机制为：早期的外泌体随着细胞膜内出芽过程的开始而形成，也称早期核内体（early endosomes，EE），接着早期核内体二次内出芽形成各种管腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），形成晚期核内体，包含腔内囊泡的晚期核内体称为多泡体（multivesicular bodies，MVBs），在胞外分泌过程中多泡体包含的腔内囊泡可以从多泡体的内腔释放到胞外环境中，所释放的腔内囊泡即为外泌体［6］。有研究显示外泌体的释放主要由Rab家族蛋白调节，其中Rab27a 和Rab27b控制不同阶段外泌体分泌途径［7］；其次，Rab35和Rab11通过与10A-C结合也能调节其分泌［8］。

1.2 外泌体的基本生物学特性

外泌体是在某些特殊生理或者病理状态下，细胞选择性地将一部分蛋白以及遗传物质包裹进入囊泡继而释放到细胞外环境中的微泡结构。目前，主要依据微泡结构的直径大小将它们大致分为3类：微粒（microparticle，直径100 μm～1 nm）、外泌体（直径30～100 nm）和凋亡小体（apoptotic body，直径1～4 μm）。外泌体内含有大量且种类繁多的蛋白质、mRNA及miRNA 等生物活性物质。目前已被识别的常见外泌体蛋白包括：转膜蛋白和融合蛋白（ Rab GTPases、flotillin、膜联蛋白）、多泡体生成相关的蛋白（Alix、TSG101）、4次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82）、热休克蛋白（HSP）（HSP70、HSP90）、脂质相关蛋白和磷脂酶以及与外泌体来源相关的细胞特异性蛋白［9］。有研究显示，通过质谱分析法检测骨髓间充质干细胞来源的外泌体稳定表达154种蛋白质，在这些蛋白质中，可能与治疗作用相关的包括表面受体（PDGFRB、EGFR、PLAUR） 、信号分子（RRAS/NRAS、MAPK1、GNA13 /GNG12、CDC42 和VAV2） 、黏附分子（FN1、EZR、IQGAP1、CD47、整合素、LGALS1/LGALS3）等［10］。这些蛋白质都与其发挥生物学功能密切相关。

1.3 外泌体的分离及鉴定

目前公认的比较严格且广泛使用的提取方法为蔗糖梯度离心法，首先将收集到的样品液以100 000～110 000 g的转速连续离心制成外泌体球团，重悬外泌体后以同样方法再次制作外泌体球团［11］。外泌体可在密度为1.13～1.19 g/ml时悬浮，因此，可在超净环境下使用蔗糖梯度对其进行分离。目前，新近出现了一些外泌体提取方法，譬如微流体元件、抗体涂成磁珠分选、化学沉淀法及过滤分选法等［12］，其分离效果有待进一步研究证实。

外泌体直径为30～100 nm，用普通光学显微镜无法分辨。电子显微镜（electron microscopy analysis，ETM）是初步鉴定外泌体的基本手段。除此之外，动态光散射分析（dynamic light scattering analysis，DLS）［13］，纳米离子跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）［14］均可通过检测外泌体直径对其进行鉴定。其中，纳米离子跟踪分析还可检测外泌体浓度。外泌体进一步鉴定方法有蛋白印记及流式细胞术，质谱分析及成像技术等［15］。

1.4 外泌体介导的细胞信号传导

外泌体一旦释放，既可直接与周围环境中细胞相互作用，也可进入体循环乃至血脑屏障［16］发挥细胞间信息传递及免疫调节等生物学效应。目前，通过外泌体传递基因信息已成为表观遗传学调控的一个新领域。很多基于免疫荧光的方法证实，特定器官细胞来源的外泌体能够选择性绑定某种靶细胞并被其内化，发挥特定生物学功能。外泌体与受体细胞相互作用的具体机制还不是很清楚，目前比较公认的机制认为外泌体通过特异性受体与受体细胞膜绑定，受体细胞即可通过胞饮方式溶解外泌体囊泡膜使其特异性蛋白、脂质及RNA释放至细胞质，也可通过其独特的内吞作用将外泌体内化［17］。随后，外泌体通过转移蛋白质、mRNA及miRNA调节局部及整体细胞间的信息交流，进而诱导受体细胞发生相应的生理改变。外泌体比较重要的功能有通过促血管生成作用加速肿瘤的进展、肿瘤转移［18］、抗原呈递及免疫应答、控制纤维化［19］及影响干细胞治疗活性等［20］。国外最新研究显示， 表达EGFRvⅢ的神经胶质瘤细胞能通过分泌外泌体把自身携带的EGFRvⅢ转运给不表达EGFRvⅢ的胶质瘤细胞并促进其恶性增殖。此外，Tomasoni等［21］研究发现骨髓间充质干细胞源外泌体（BMSCs-exosomes）通过向受体细胞传递特异性mRNA促进细胞增殖。慢性粒细胞性白血病来源的外泌体可刺激MSCs释放白细胞介素-8 （IL-8），进而加速白血病的进程［22］。因次，外泌体被认为是细胞间传递蛋白、mRNA及miRNA的载体。

2 外泌体与心肌梗死

2.1 外泌体在心肌修复中的作用

外泌体早期研究中，目光多聚焦在外泌体与肿瘤发生、发展机制的研究。已有研究证实外泌体源性miRNA通过抑制其靶基因的转录，表现出具有诱导细胞迁移、调节免疫应答、促进血管发生从而发挥影响转移前微环境形成及促进转移等致瘤作用［23］。随着研究的深入，外泌体在心血管疾病发生、发展及治疗中的重要角色逐渐被发现。Barile等［24］首次通过电镜在超微结构中发现了心肌祖细胞中外泌体的存在。Vrijsen等［25］证实来源于心肌祖细胞的外泌体在体外抓伤实验中能够促进内皮细胞的迁移，提升内源性心肌再生能力。Tomasoni等［21］研究证实外泌体在心肌细胞缺血性损伤时发挥保护作用，可能机制是通过传递某些保护性miRNA，促进有利于心肌修复微环境的产生。这些研究发现为后续外泌体对缺血心肌修复机制相关研究奠定基石。

2.2 外泌体源性miRNA与心肌梗死

miRNA是近年来发现的一组内源性高度保守的小分子非编码单链，约由22个核糖核苷酸组成，通过调控基因表达和蛋白质翻译过程，进而调节细胞和生物体内重要的生命活动。研究发现急性心肌梗死和心绞痛患者血浆外泌体中miR-1和miR-133a 的表达水平较正常人显著升高［26］。另外，有研究证实，循环中与P53基因相关的多种miRNA（miR-92、miR-194以及miR-34a）在急性心肌梗死后心力衰竭发生的早期阶段明显上升，且miR-194以及miR-34a主要被包裹于外泌体中而被心肌细胞主动性地分泌至外周循环中。说明外泌体源性miRNAs在循环中的水平与心肌梗死后心力衰竭状态下左心室舒张末期容积相关性。因此这些外泌体相关的miRNAs可能成为心肌梗死后心力衰竭发生的早期诊断标志物。有实验还表明急性心肌梗死后miR-150 在骨髓单核细胞的表达量下降，引起趋化因子受体4（CXCR4）蛋白表达量升高，从而增加了CXCR4 诱导骨髓干细胞迁移归巢到受损心肌处的作用。这提示心肌梗死后可以通过调控包含miR-150 的外泌体含量来增加这一迁移作用，从而改善心肌的修复［27］。此外，研究发现胚胎干细胞（embryonic stem cells， ESCs）来源的外泌体可提高心肌梗死后新生血管的形成、促进心肌细胞存活及降低心脏纤维化。进一步体外研究发现胚胎干细胞源外泌体主要通过向受体心脏祖细胞（cardiac progenitor cells， CPCs）传递miR-294，促进心脏祖细胞的存活及增殖［28］。Barile等［29］研究发现心脏祖细胞来源的外泌体内miR-210及miR-132高表达，且miR-210通过下调其目标基因ephrinA3及PTP1b，抑制心肌细胞凋亡；miR-132可抑制目标基因RasGAP-p120表达，增强内皮细胞血管生成能力。向心肌梗死心脏注射心脏祖细胞源外泌体可抑制心肌细胞凋亡，促进新生血管形成，提高左心室射血分数。Tseliou 等［30］研究发现心球样细胞来源的外泌体作用于成纤维细胞可改变成纤维细胞表型及成纤维细胞内miRNA内容，促使其分泌更高水平的基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及血管内皮细胞生长因子（VEGF），促进心肌梗死后心功能的恢复。此外，新近研究发现心肌内注射诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）来源的外泌体可通过向心肌细胞传递心脏保护性miR-21及miR-210，保护受损心肌免受缺血再灌注损伤［31］。

2.3 预处理外泌体在心肌梗死中的治疗效果

目前大量研究采取预处理的方式提高外泌体对心肌梗死的治疗效果。Vicencio 等［32］研究发现，缺血预处理大鼠血液来源的外泌体可通过高表达的HSP70激活TLR4，进而激活MERK/ERK1/2通路致使HSP27磷酸化，对缺血后的心脏发挥保护作用。同样，Yamaguchi等［33］研究发现，缺血预处理大鼠血液来源的外泌体内miR-29a及IGF-1R高表达，降低心肌梗死后氧化应激反应及心脏纤维化，改善心室重构。Gray 等［34］证实，与常氧组比较，缺氧预处理心脏祖细胞来源的外泌体显著增强内皮细胞血管生成能力，降低促纤维化基因转化生长因子-β（TGF-β）的表达，减少心肌梗死后心脏纤维化，改善心功能。此外，Yu 等［35］通过Microrna矩阵分析证明过表达心肌转录因子GATA-4的间充质干细胞所提取的外泌体中miR-192和miR-451表达增高，外泌体通过向心脏祖细胞及心肌细胞传递高表达的miRNA发挥抗细胞凋亡、减少乳酸脱氢酶（LDH）释放的作用，从而改善心肌梗死后心脏功能。Ong 等［36］研究证实过表达缺氧诱导因子-1 （HIF-1）的心脏祖细胞提取的外泌体内miR-126及miR-210含量更高，并可通过向受体心脏祖细胞传递心脏保护性miR-126及miR-210，激活受体心脏祖细胞促存活激酶，降低代谢需求，提高缺氧环境下心脏祖细胞耐受能力，改善心肌梗死后心脏祖细胞移植的疗效。Kang等［37］通过体外研究发现过表达CXCR4的间充质干细胞来源的外泌体可显著上调心肌细胞内胰岛素样生长因子-1α（IGF-1α）及磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶（PAKT）水平，下调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）表达，促进VEGF的表达及血管的生成。同时，体内研究证实过表达CXCR4的间充质干细胞来源的外泌体可促进心肌梗死后新生血管的形成，减少心肌梗死面积，改善心室重构，进而促进心肌梗死后心功能恢复。

3 展望

大量研究已证实，外泌体可作为细胞间信息交换，是传递信号分子以激活远隔器官的重要载体。外泌体的这些生物学功能与其携带的大分子遗传物质密切相关。其中，miRNA在心肌梗死治疗中的疗效尤为突出，成为心肌梗死治疗领域的研究热点。近年来，外泌体来源的长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）在心血管研究领域中的角色逐渐受到重视。本课题组所承担的一项国家自然科学基金《心脏干细胞源外泌体LncRNA对急性心肌梗死后心肌修复的调控机制研究》中，重点研究外泌体来源的LncRAN对缺血缺氧环境下心脏的保护作用。尽管外泌体在心血管领域的研究还处于起步阶段，相信经过深入研究及不懈的努力，外泌体对心肌梗死后的心肌修复机制会得到深入了解。外泌体的发现将会为心肌梗死的患者带来福音。

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（编辑：漆利萍）

收稿日期：（ 2015-11-16）

基金项目：国家自然科学基金 （81560041）

作者单位：563003 贵州省遵义市，遵义医学院附属医院 心血管内科

作者简介：李玲 硕士研究生 研究方向为冠心病介入治疗 Email：1658543307@qq.com 通讯作者：石蓓 Email： shibei2147@163.com

中图分类号：R54

文献标识码：A

文章编号：1000-3614（2016）06-0615-04

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.06.023