金纳米粒子生物毒性的研究进展

王 勇 高 斌 贺克武

金纳米粒子生物毒性的研究进展

王 勇 高 斌 贺克武

纳米复合物；金；毒性；综述

金纳米材料（gold nanoparticles，GNPs）是最稳定的贵金属纳米材料之一，纳米级别的金纳米材料具有宏观金粒子所不具备的物理性质，如量子效应、小尺寸效应、表面效应、光学效应等。金纳米材料的形式表现多种多样，如球形、星形、棒状、壳状等，在免疫检测、细胞成像、光热治疗、放疗增敏等生物医学领域具有广阔的应用前景［1-3］。然而，由于纳米材料与常规物质的理化性质不同，其生物安全性越来越受到重视。国内外研究显示，将一些正常物质由微米级制作成纳米级后，即可能具有潜在的生物毒性。因此，重视金纳米技术的安全问题，在组织、细胞及基因层面系统性地评估金纳米粒子的应用与风险非常关键。

1 金纳米粒子在组织的分布

大量金纳米粒子与小鼠的实验研究表明，金纳米粒子可广泛存在于小鼠各器官组织中（表1）［4-8］，如肝脏、肾脏、脾脏、肺、心脏、脑、睾丸、骨骼、肌肉等。这些金纳米粒子经各种途径进入小鼠各器官与组织后，与各器官组织、细胞和生物分子接触，可能会产生多种潜在的生物效应，对小鼠的健康产生影响。Sonavane等［7］研究发现，15～50 nm的金纳米粒子可以通过小鼠血-脑屏障进入脑组织并积累。Zhang等［9］在实验研究中使用13.5 nm的金纳米粒子经灌胃法喂养小鼠14 d［2.2 mg/（kg·d）］，在血液及骨髓细胞中均发现了金纳米粒子的分布。

2 金纳米材料的细胞毒性

2.1 金纳米粒子尺寸对细胞毒性的影响 既往实验研究发现，金纳米粒子的尺寸与毒性之间具有依赖关系：金纳米粒子尺寸越小，对细胞的毒性越强。Pan等［10］报道相对于15 nm的金纳米粒子，1.4 nm金纳米粒子对结缔组织成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞、黑色素瘤细胞有更大的细胞毒性。Liu等［11］指出5 nm的金纳米粒子可以阻滞肺癌A549细胞株的细胞增殖，而20 nm与40 nm的金纳米粒子则没有这种阻滞效果。Abdelhalim［12］将10 nm、20 nm、50 nm的金纳米粒子经腹腔注入小鼠体内后饲养3 d或7 d，发现心肌细胞出现代谢及结构障碍、心肌细胞的改变与心肌细胞的细胞质液化、慢性炎症细胞等作用有关。该实验中心肌细胞的改变与金纳米粒子的尺寸与时间具有依赖关系：金纳米粒子的尺寸越小、接触时间越长，心肌的改变程度越明显。在此基础上，Abdelhalim等［13］又发现10 nm、20 nm、50 nm金纳米粒子使小鼠肝细胞在慢性炎症细胞的作用下出现水肿、脂肪变性、肝血窦扩张充血等改变，而且所用金纳米粒子的尺寸和接触时间均影响肝细胞改变的程度。同时，金纳米粒子可能存在一个最佳的细胞吸收尺寸，Chithrani等［14］报道，Hela细胞对14 nm、50 nm金纳米粒子的吸收能力因金纳米粒子的尺寸不同而产生差异，金纳米粒子的饱和浓度也不同，并发现50 nm金纳米粒子能被Hela细胞最有效吸收。

Cardoso等［15］将10 nm、30 nm金纳米粒子与生理盐水均按70 μg/kg注入小鼠体内，24 h或28 d后采用斩首法处死全部小鼠，发现小鼠急性或慢性摄入金纳米粒子均对脑皮质DNA有损伤作用，小鼠急性摄入金纳米粒子（24 h）后，30 nm金纳米粒子组对小鼠脑皮质的损伤作用高于10 nm金纳米粒子组，差异有统计学意义（P＜0.01）。这一研究表明金纳米粒子的细胞毒性可能是金纳米粒子的多种理化性质和所作用的细胞系共同决定的，尺寸影响细胞对金纳米粒子的吸收能力和饱和浓度，并不能决定其细胞毒性。

【作者单位】 安徽医科大学第三附属医院介入科 安徽合肥 230061

2.2 金纳米粒子浓度对细胞毒性的影响金纳米粒子的浓度也是其影响细胞功能的一个重要因素，其可能原因是粒子浓度增多，大量粒子进入细胞质，破坏了亚细胞结构功能及细胞的增殖、运动和形态［16］。Ajdary等［17］将浓度为25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的金纳米粒子（平均为10 nm）置入小鼠体内14 d（注射法剂量为0.3 ml/d，灌胃法剂量为0.2 ml/d），取小鼠血样本及肾脏组织。肾脏病理分析发现，与对照组比较，低浓度组（25 mg/L）小鼠肾实质和肾髓质表现正常，肾小体中肾小球与肾小囊显示明显；中浓度组（50 mg/L）中肾皮质改变明显，肾小囊消失，肾小球仍然可见；高浓度组（100 mg/L）中，肾皮质与肾小体均消失，小体周围毛细血管网扩张。Pernodet等［18］将不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/ml）的柠檬酸包覆的金纳米粒子（14 nm）与人真皮成纤维细胞相互作用，发现真皮成纤维细胞增殖数量与浓度成反比；电子显微镜下进一步观察发现，随着金纳米粒子浓度增高，尽管不同浓度组细胞中肌动蛋白数量仍基本相同，但是肌动蛋白的直径却越来越小，表明金纳米粒子能作用于肌动蛋白的表达，影响细胞增殖、运动和黏附能力。

2.3 金纳米粒子不同形状及表面修饰对细胞毒性的影响金纳米粒子的形状可以影响其细胞毒性。Favi等［19］使用多分枝星形金纳米粒子［AuNSTs，（33.69±8.45）nm］与裸露的球形金纳米粒子［AuNSPs，（61.46±4.28）nm］作用于人皮肤成纤维细胞和鼠脂肪垫内皮细胞，结果发现，当AuNSPs浓度达到40 μg/ml时对两种细胞均有致死作用，而AuNSTs浓度达到400 μg/ml时对两种细胞的毒性作用仍弱于AuNSPs浓度。但是该实验并不能完全说明金纳米粒子不同形状对细胞毒性有差异性的影响。尺寸影响细胞对粒子的细胞吸收能力，而该实验所用的两种金纳米粒子直径并不相同。

金纳米粒子的表面经不同生物分子修饰后，具有特定的功能，可以应用于不同环境中。因为金纳米粒子进入生物体内通常均经过表面修饰，故表面修饰物可能会影响其生物利用率。Zeng等［20］研究二氧化硅包覆的金纳米粒子（GNSs）与裸露的金纳米棒（GNRs）在不同表面配体作用［柠檬酸与十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）修饰］下对HepG2肝癌细胞增殖和形态的影响，在浓度为0.625 pmol/L、CTAB-GNSs 与CA-GNSs尺寸为45 nm时，CTAB-GNSs使细胞生存率减少了60.9%，细胞毒性明显；而柠檬酸修饰的GNSs（CAGNSs）几乎无细胞毒性。CTAB-GNSs的半抑制浓度（IC50）为0.5 pmol/L，明显低于CA-GNSs的IC50（200 pmol/L）。Niidome等［21］在Hela细胞研究中采用MMT分析发现，CTAB-GNRs浓度为0.5 mmol/L有很大的细胞毒性，细胞死亡率为80%；用聚乙醇修饰剂代替CTAB后，细胞存活率为95%。上述结果表明，金纳米粒子表面修饰物的不同对细胞的增殖和形态的影响具有差异性。

2.4 金纳米粒子产生细胞毒性的机制 一般认为粒子经内吞作用被细胞摄取后积聚在核内体或溶酶体，但是目前对金纳米粒子产生细胞毒性的机制尚不明确。由于金纳米粒子形状不同、尺寸大小、表面修饰物的种类甚至表面zeta电位及作用细胞类型不同等，均可能导致细胞毒性产生的机制有差异。金纳米粒子的细胞毒性机制可能是由于其可以引起细胞中自噬小体的表达和积聚，溶酶体功能障碍，活性氧和活性氮的产生。Ma等［22］报道10～50 nm金纳米粒子的依赖吸收可引起小鼠肾脏细胞自噬体的积累和溶酶体修复障碍。Jia等［23］认为金纳米粒子会引起氮的氧化物释放到血清中，引起细胞毒性。Ng等［24］报道金纳米粒子会使人肺成纤维细胞MRC-5出现自噬及氧化应激，同时观察到自噬小体的形成和自噬相关蛋白MAC-LC3及ATG7的上调及脂质过氧化作用，蛋白质免疫印迹分析检测到丙二醛，进一步确定细胞发生了脂质过氧化。

3 金纳米材料的基因毒性

目前金纳米粒子的毒性研究以生物代谢及细胞研究为主，基因毒性研究相对较少。金纳米粒子对哺乳细胞系的基因毒性主要有DNA损伤、染色体断裂、编码蛋白表达异常等。Chueh等［25］进行了金纳米棒（平均长度10～40 nm）对人肺成纤维细胞MRC-5的基因毒性研究，发现金纳米棒会使MRC-5细胞产生应激反应。脱氧核糖核酸微阵列分析显示，这种应激反应在其DNA损伤反应与修复、细胞周期调控、氧化还原稳态中一直存在；ABC转运蛋白在细胞增殖与抑制金纳米棒对细胞及基因毒性中也发挥作用。聚类分析、信号通路和基因本体分析显示，基因表达了大量编码蛋白，以p53（3.1倍）、BRCA1（4.3倍）为著。同时，金纳米棒还引起BER修复基因及同源重组相关基因的表达，表明金纳米粒子会引起DNA损伤和染色体断裂，错配修复和跨损伤DNA合成的相关基因如MLH3，Rev1表达增加。Balansky等［26］将剂量为3 mg/kg金纳米粒子（40 nm、100 nm）悬浮液在雌鼠妊娠期10 d、12 d、14 d、17 d经胎盘注入，结果100 nm组胎鼠的肝脏及外周血嗜多染红细胞微核率显著增加，miRNA表达增加。对实验中胎鼠1280种miRNA进行分析，100 nm组胎鼠肺中28种miRNA上调2倍以上，差异有统计学意义（P＜0.05）；胎鼠肝脏中5种miRNA上调，其中Let-7a与miR-183在肺和肝脏中均上调。该实验证明了金纳米粒子对胎鼠DNA具有损伤及影响相关表观遗传变化。

在细菌方面，Wang等［27］研究显示，金纳米粒子（16 nm）对TA102鼠伤寒沙门菌株有致突变作用。而Lopes等［28］对TA98/TA100鼠伤寒沙门菌株及费氏弧菌研究显示，金纳米棒（横径10 nm，长径35 nm）对3者均无致突变效应。由于金纳米粒子不能通过细菌细胞壁，部分学者认为金纳米材料关于细菌的基因毒性研究没有意义。

4 讨论及展望

金纳米材料由于其独特的理化性质，在医学上展现了巨大的应用潜力，故其对生物体安全性的研究势在必行。金纳米材料可在生物体内各组织分布，并具有细胞毒性和基因毒性；影响细胞的增殖和形态，使细胞发生凋亡、自噬；引起细胞DNA损伤及染色体断裂。上述生物毒性与金纳米材料的尺寸、形态、浓度、表面修饰物等均有一定的联系。综合分析上述因素的作用，探索金纳米材料产生生物毒性的机制，寻找一种理想尺寸、形态及表面修饰物的金纳米材料将会是金纳米材料下一步的研究重点。

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（本文编辑 张春辉）

O614.123

10.3969/j.issn.1005-5185.2016.06.018

国家自然科学基金面上项目（81071240）。

高 斌 E-mail: gaobin_3136@163.com

2015-11-16

2016-02-02