蝇蛆肽的发酵法制备及其对果蝇的延寿作用

武金霞，刘青，刘禹杉，王静之，张贺迎

(1. 河北大学 生命科学学院，河北 保定　071002；2.河北大学 生物技术研究中心，河北 保定　071002)



蝇蛆肽的发酵法制备及其对果蝇的延寿作用

武金霞1，刘青1，刘禹杉1，王静之1，张贺迎2

(1. 河北大学 生命科学学院，河北 保定071002；2.河北大学 生物技术研究中心，河北 保定071002)

摘要：以米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042转化蝇蛆蛋白，蝇蛆蛋白的主要组分91.8 ku蛋白经发酵后被降解，转化形成了分子质量为4.3~65.9 ku的蝇蛆肽，发酵液中蝇蛆肽质量浓度为7.9 mg/mL，肽转化率为31.6%.在饲喂雌雄黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的基础培养基中分别添加蝇蛆肽，使其质量分数为0，1%，2%，4%，每天分组记录果蝇的死亡数目和存活时间，直至果蝇全部自然死亡.结果表明，饲喂高浓度蝇蛆肽的雌雄果蝇的平均寿命和平均最高寿命均显著延长，提示蝇蛆肽具有一定的抗衰老作用.

关键词：蝇蛆肽；黑腹果蝇；最高寿命；抗衰老作用

第一作者：武金霞(1966-)，女，河北曲阳人，河北大学教授，博士，主要从事生化药物及基因工程药物研究.

E-mail：wjx6@163.com

E-mail：z660128@163.com

家蝇(Muscadomestica) 能在极其恶劣的环境中生存，与其表达抗菌肽、抗菌蛋白及抗病毒成分有关[1-3]，研究表明家蝇幼虫(Muscadomesticalarvae)即蝇蛆浸提液还具有抗氧化、抗辐射等作用[4-5].蝇蛆不但含有许多活性成分，还是优质蛋白资源，其粗蛋白含量达59%~65%[6-7]，目前蝇蛆多用来部分替代鱼粉做蛋白质饲料饲喂畜禽[8-9].受传统饮食习惯的影响，人们直接食用蝇蛆原形态产品受到一定限制，目前仅有少数作者研制了蝇蛆蛋白饮料和果冻[10-11].将蛋白质限制性降解，可得到外源性生物活性肽，经肠道吸收后发挥各种生理功能.有报道称投喂利用酶解法转化蝇蛆制备的蝇蛆肽，可提高大鼠免疫力和改善小鼠生长发育状况[12-13].本研究以米曲霉(Aspergillusoryzae)发酵蝇蛆蛋白制备了蝇蛆肽，并研究了蝇蛆肽对果蝇的延寿作用，为深度开发蝇蛆蛋白资源提高其附加值提供了新的思路.

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1材料及试剂

新鲜蝇蛆(河北大学动物学实验室提供)；黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(河北大学遗传学实验室提供).牛血清白蛋白、低分子质量蛋白Marker、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、Tris、Tricine均购自Sigma公司.

1.1.2仪器

高速冷冻离心机(Sigma 公司)；722型可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)；稳流稳压电泳仪(DYY-16D型，北京市六一仪器厂)；冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；凝胶成像分析系统(Bio-Best 300M(GOLD-SIM公司)；全自动高速冷冻离心机(GL20A，湘西仪器仪表总厂).

1.2　方法

1.2.1蝇蛆浸提原液的制备及检测

称取一定量新鲜蝇蛆，按每g蝇蛆加4 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)的比例加入缓冲液,组织捣碎机捣碎， 4 ℃冰箱浸提10 h，12 000 r/min离心15 min，弃沉淀，上清液为蝇蛆浸提原液，多次浸提原液合并冷冻干燥后备用.以牛血清白蛋白为标准蛋白，以Folin-酚法测定蝇蛆浸提原液的蛋白质浓度，SDS-PAGE检测蝇蛆浸提原液中蝇蛆蛋白组分，分离胶质量分数10%.

1.2.2米曲霉发酵蝇蛆蛋白制备蝇蛆肽

以蒸馏水溶解蝇蛆浸提原液冻干粉(唯一氮源)，使蛋白质质量浓度为25.0 mg/mL，每100 mL加入2 g葡萄糖，0.1 MPa灭菌30 min.接种米曲霉孢子，32 ℃，180 r/min，震荡培养.每隔24 h取样，6 000 r/min离心除去菌丝体，得上清液，以0.5 mol/L三氯乙酸沉淀大分子蛋白，静置30 min后再次离心，得上清液，再以双缩脲法测定上清液中蝇蛆肽的含量.Tricine-SDS-PAGE检测蝇蛆肽的分子质量分布.

1.2.3蝇蛆肽对果蝇的延寿作用

2结果

2.1　蝇蛆浸提原液的蛋白组分分析

在上述实验条件下得到的蝇蛆浸提原液蛋白质质量浓度为9.88 mg/mL，其蛋白质组分见图1.

由图1可知，蝇蛆浸提原液中以分子质量为91.8 ku 的条带含量最高，还有一些分子质量较小的肽，但含量很低，91.8 ku组分是蝇蛆浸提原液中的主要蛋白质组分.

2.2　米曲霉发酵制备的蝇蛆肽的分子质量分布检测

米曲霉发酵蝇蛆蛋白过程中蝇蛆肽形成曲线如图2.

1.蝇蛆浸提原液；2.标准蛋白质.

图2　米曲霉发酵过程中蝇蛆肽质量浓度曲线

由图2可知，发酵24 h发酵液中蛋白质质量浓度急剧下降，肽的质量浓度与最初相比也有所降低，是由于米曲霉利用蝇蛆浸提原液中蛋白质和肽作为氮源生长所致.随着发酵时间延长，米曲霉逐渐生长，肽的形成逐渐增多，当发酵96 h时蝇蛆肽的质量浓度达到最高为7.9 mg/mL，肽转化率达31.6%.发酵120 h 蝇蛆肽的质量浓度稍有下降，144 h 蝇蛆肽质量浓度有所提高，达7.5 mg/mL，继续发酵，则米曲霉菌丝体出现自溶现象，菌体细胞破裂，内容物释放，因此选取发酵96 h制取蝇蛆肽.

SDS-PAGE 及Tricine-SDS-PAGE检测米曲霉发酵后蝇蛆蛋白转化为蝇蛆肽的组分及分子质量分布(图3，4).

1-6.发酵24 ，48 ，72 ，96 ，120 ，144 h的蝇蛆浸提液.

由图3可知，发酵24 h 时几乎检测不到蝇蛆肽，是因为米曲霉在无其他氮源情况下利用蝇蛆蛋白生长繁殖所致.随着发酵时间延长，米曲霉不断将蝇蛆蛋白降解转化，形成分子质量较小的蝇蛆肽.发酵144 h，形成a-h 8条明显的条带，分子质量分别为65.9，49.8，49.2，44.7，29.8，25.8，25.6，22.4 ku.SDS-PAGE不能检测到分子质量几ku的肽类，Tricine-SDS-PAGE可以弥补其不足，用来检测是否有更小的肽类形成，见图4.

1.蝇蛆浸提原液；2-7.发酵24，48，72 ，96 ，120 ，144 h的蝇蛆浸提液.

图4显示，米曲霉发酵96~144 h，夹层胶能检测到a，b，c 3个肽，分子质量分别为21.2,15.6，10.9 ku；致密胶中显示发酵96 h产生e，f条带，发酵120 h和144 h产生d，f条带，条带d,e,f的分子质量分别为5.9，5.0， 4.3 ku.结合图3可知，蝇蛆蛋白主要成分91.8 ku大分子质量蛋白，经米曲霉发酵转化为分子质量分布从4.3 ku到65.9 ku的蝇蛆肽，说明蝇蛆肽种类丰富且转化率很高.

2.3　蝇蛆肽对果蝇的延寿作用

图5显示，对照组雌性果蝇的最少存活时间为34 d，半数存活时间为53 d，该组最高寿命为59 d；饲喂低、中、高质量浓度蝇蛆肽的雌性果蝇最少存活时间分别为38，36，43 d，与对照组相比延长了4，2，9 d，半数存活时间为56，58，66 d，延长了3，5，13 d，最高寿命为78，76，82 d，延长了8，17,23 d.统计分析结果，用高质量浓度蝇蛆肽饲喂的雌性果蝇显著地延长了平均存活时间和最高寿命.

图6可知，对照组雄性果蝇的最少存活时间为33 d，半数存活时间为51 d，其最高寿命为61 d；饲喂低、中、高质量浓度蝇蛆肽的雄性果蝇最少存活时间分别为35，36，45 d，与对照相比延长了2，3，12 d，半数存活时间为51，63，66 d，延长了0，12，15 d,最高寿命为74，77，82 d，延长了13，16，21 d，用高质量浓度蝇蛆肽饲喂的雄性果蝇显著地延长了平均存活时间和最高寿命.

图5　蝇蛆肽对雌果蝇的延寿作用

图6　蝇蛆肽对雄果蝇的延寿作用

3讨论

米曲霉是安全的传统酿造微生物，具有很高的蛋白酶活力，在米曲霉发酵过程中产生丰富的蛋白酶将蝇蛆蛋白降解为分子质量大小不同的蝇蛆肽，发酵和酶解同步完成，与单纯酶解法相比具有成本低、转化率高的特点.本研究中，米曲霉发酵96 h蝇蛆肽的转化率达31.6%.饲喂蝇蛆肽之后，雌雄果蝇的平均寿命和平均最高寿命均有显著延长，提示蝇蛆肽具有一定的抗衰老作用.米曲霉蛋白酶具有较广泛的底物特异性，发酵过程中除了形成蝇蛆肽之外，还形成少量游离氨基酸，一般认为蛋白质和游离氨基酸成分主要为动物提供营养，因此可以认为起延缓衰老作用的是蝇蛆肽.衰老作为与生命体氧化损伤有关的复杂的生命现象，是由于机体代谢产生的活性氧成分造成的损伤累积引起的[15]，衰老进程中能量代谢与物质代谢及信号转导相关基因的表达水平会降低，导致机体代谢能力下降，蝇蛆肽的抗衰老作用究竟与其调节哪些基因的表达有关，值得深入研究.

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(责任编辑：赵藏赏)

Preparation ofMuscadomesticalarvae peptides

by fermentation and its anti-aging effects

WU Jinxia1, LIU Qing1, LIU Yushan1, WANG Jingzhi1, ZHANG Heying2

(1. College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002,China;

2. Research Center of Biotechnology, Hebei University,Baoding 071002,China)

Abstract:The main protein component of 91.8 ku extracted from Musca domestica larvae was degraded into smaller peptides which molecular weight was from 4.3 to 65.9 ku after fermentation by Aspergillus oryzae and the mass concentration of peptides in fermentation liquor was 7.9 mg/mL，the conversion rate was 31.6%. Male and female Drosophila melanogaster was divided into four groups randomly and fed with culture media containing 0, 1%，2%，4% of the peptides lyophilized powder . The death number and the survival days of D. melanogaster was recorded every day until all the D. melanogaster died. The results showed that the average life span and average maximum life span of male and female D. melanogaster was increased significantly, suggesting the M. domestica larvae peptides possessed anti-aging effects.

Key words:Musca domestica larvae peptides; Drosophila melanogaster; maximum life span; anti-aging effects

通信作者：张贺迎(1966-)，男，河北大城人，河北大学副研究员，主要从事生化药物及基因工程药物研究.

基金项目：河北省生物工程重点学科资助项目(1050-5030023)；河北省生物学强势特色学科资助项目.

收稿日期：2015-04-12

中图分类号：Q936;Q939.9

文献标志码:A

文章编号：1000-1565(2015)06-0605-05

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.06.009