转基因动物制备技术

刘红林（南京农业大学动物科技学院袁江苏南京210095）



转基因动物制备技术

刘红林
（南京农业大学动物科技学院袁江苏南京210095）

摘要院所谓转基因动物是指基因组整合有外源基因袁并且能将外源基因稳定遗传给后代的一类动物遥本文简要介绍了转基因动物制备技术的受精卵原核显微注射法尧干细胞嵌合体法尧体细胞克隆法和病毒载体法四种主要技术的原理尧方法及优缺点遥

关键词院转基因动物；制备技术

所谓转基因动物是指基因组整合有外源基因，并且能将外源基因稳定遗传给后代的一类动物。

在物种的形成与进化过程中，基因交流一直在发生。研究认为，哺乳动物线粒体可能来源于古细菌，而基因组中的原癌基因序列可能源自于病毒DNA；另一方面，一个种群也会通过杂交方式掺入其他种群的血缘，如无氟烷基因皮特兰猪种的建立。皮特兰猪种是世界上瘦肉率最高的猪种，但具有引发应激综合征的有害氟烷基因，氟烷基因是兰尼定受体基因的一种突变类型，在皮特兰猪种纯合。商业化去除皮特兰猪种氟烷基因的策略是：将皮特兰猪与大白猪杂交，杂种猪为具有1个氟烷基因和1个正确兰尼定受体基因的杂合子，继而将杂种猪与皮特兰猪回交，回交1代猪有一半为氟烷基因杂合子，采用分子生物学技术选出杂合子猪，再将杂合子猪与皮特兰猪回交，选出后代猪群中的杂合子再与皮特兰回交，这样经过多代回交，最终的回交猪群皮特兰猪种的血缘可以超过97%，回交猪群的杂合子猪自交，后代约有1/4不含氟烷基因，采用分子生物学技术将其选出，就可获得无氟烷基因的皮特兰猪新种群，从而在皮特兰新猪群中成功用大白猪的兰尼定受体基因替代了有害氟烷基因。与传统的基因交流不同，转基因技术是利用分子分物学技术将少数或个别基因导入宿主基因组，而且外源基因的来源更加广泛，如将线虫的fat-1基因导入猪基因组。

转基因动物制备技术可以归纳为以下四种主要的类型：受精卵原核显微注射法、干细胞嵌合体法、体细胞克隆法和病毒载体法，现将此四种技术方法分别介绍如下。

1　受精卵原核注射法

对于有性生殖的动物来说，生命起源于单细胞受精卵，构成动物有机体多种多样的细胞拥有一个共同的祖先细胞，即受精卵。生命初期，精子与卵子融合形成受精卵，在受精卵细胞质中精子与卵子的遗传物质分别形成雄原核和雌原核，十多个小时后受精卵进入有丝分裂中期，此时精子与卵子的遗传物质才混合在一起。雌、雄原核虽然处于同一个细胞质中，但两者有许多不同，最易观察的是两者体积存在差异，雄原核体积较大。受精卵原核注射法即采用显微技术将外源基因注入雄原核。实践证明，注入雄原核的外源基因会整合进入部分胚胎的基因组中，从而在后代中获得一定比例的转基因个体。受精卵原核注射法是应用最为广泛，也是最早、最经典的方法，其优点是：导入过程直观、外源基因（DNA）的大小不受限制、没有化学试剂等对细胞的毒性作用；缺点也比较明显：需要昂贵的设备与技术难度很大的复杂操作，胚胎因受到的机械损伤较大而存活率下降，外源基因随机整合，导入基因沉默现象多有发生，效率较低。

2　干细胞嵌合体法

动物胚胎附植前发育存在一个被称为囊胚期的发育阶段，小鼠受精卵大约经过3～4天的发育进入囊胚期，囊胚是中空的球状结构，由外周滋养层细胞和内部的内细胞团细胞组成，滋养层细胞发育成胎盘，而内细胞团发育成胚体。内细胞团细胞具有分化形成动物有机体多种多样细胞类型的能力，被称为多能性胚胎干细胞。同一物种不同类群的动物，其囊胚内细胞团混合后能够发育成被称为嵌合体的个体，所谓嵌合体是指组成动物有机体的细胞有2个或2个以上的祖先细胞来源。不同物种的嵌合体也有报道，典型的例子是2002年国际期刊《家禽科学》的一篇报道，该报道称，鸭的胚盘细胞注入鸡胚盘下腔，能够发育形成混有鸭细胞的嵌合体鸡，并且鸭细胞可以参与嵌合体鸡生殖腺的形成，在嵌合体鸡精液中检测到鸭精子，嵌合体鸡精液能使母鸭受精，获得后代鸭。干细胞嵌合体法的原理是：体外将外源基因转入胚胎干细胞基因组，然后将转有外源基因的胚胎干细胞注射到正常胚胎的囊胚腔，在后代嵌合体中检测生殖嵌合的个体，在生殖嵌合个体与正常动物个体繁殖的后代中，将产生一定比例的转基因个体。该方法突出的优点是：只需将外源基因导入干细胞，外源基因整合情况的可控性高。与将外源基因导入个体相比，外源基因导入细胞的方法多样、简单易行，且通过对外源基因在宿主细胞基因组插入位点、拷贝数以及表达特性的检测，可以筛选出适合的转基因细胞类型，从而提高转基因动物类型的可控性。但一方面由于大动物的胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞）建系困难，限制了该技术方法的应用；另一方面，利用该法获得的第一代动物均为嵌合体，获得真正的转基因个体的试验周期长、效率低。

3　体细胞克隆法

体细胞克隆的成功是生殖生物学的重大变革，意义深远。高度分化的体细胞，如皮肤细胞，植入去核的卵母细胞后体细胞核发生去分化，成为类似受精卵的全能性细胞。体细胞移入去核卵母细胞后，经人工激活可以重演早期胚胎的发育过程，移植代孕动物可以生出具有繁殖性能的个体。如果体细胞导入了外源基因，那么克隆后代同时也就是转基因动物。借助体细胞克隆法已先后获得了转基因小鼠、猪、牛、羊等动物。体细胞克隆法适用于大多数物种，且试验周期短，无需进行嵌合体育种就可直接获得转基因个体；不足之处是实验操作难度大及克隆的成功率较低。

4　病毒载体法

病毒，特别是逆转录病毒，具有感染细胞并将自身DNA整合进入宿主基因组的能力。病毒感染细胞的一个重要方面是将其遗传物质释放进入细胞，病毒DNA具有长末端重复序列的结构特征，借助这种结构特征，病毒DNA可以高效整合到宿主细胞基因组。病毒DNA的长末端重复序列具有启动下游基因转录的功能，将外源基因置于长末端重复序列下游重组病毒DNA，由此生产的病毒感染受精卵或早期胚胎后，就有可能获得转基因嵌合体后代，再经过一代繁殖得到转基因动物。在各种基因转移的方法中，通过逆转录病毒载体将基因整合入宿主细胞基因组，是最为有效的方法之一，其中慢病毒载体以其高效的整合与表达效率受到特别注意。2002年《科学》杂志报道，重组的慢病毒颗粒注射小鼠受精卵透明带与细胞膜间的卵周隙，能够高效获得转基因小鼠，随后1～2年，利用该种载体相继高效获得了转基因大鼠、牛、猪等。慢病毒载体法特别适用于家禽的转基因个体制备，禽类由于其繁殖生物学特点，适用于哺乳动物的多种转基因制备技术（如原核注射法、干细胞嵌合体法、体细胞克隆法）均难以在家禽上借用。对家禽而言，只需在新生受精蛋的胚盘下腔注入重组有外源基因的慢病毒载体，就能高效获得转基因鸡嵌合体，并且生殖嵌合的比率高。慢病毒载体法以其简单、高效成为转基因禽制备的首选技术。与其他转基因技术相比，病毒载体法操作简单，外源基因的整合效率高；但该方法对外源基因片段的大小有限制，生殖嵌合的比率较低，并且存在病毒载体可能激活基因组的原癌基因或其他有害基因的生物安全隐患。

中图分类号院S828.2

文献标识码院A

文章编号院1673-4645(2016)04-0060-02

收稿日期：2016-03-30

基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（2014ZX08006-003）

作者简介：刘红林（1966-），汉族，江苏姜堰市人，教授，博士，博士生导师，主要从事动物生物技术研究，E-mail：liuhonglin@njau.edu.cn