人乳头瘤病毒16型重组乳球菌疫苗的研制现状

李文桂(LI Wen-gui)，陈雅棠

(重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所，重庆 400016)



·综述·

人乳头瘤病毒16型重组乳球菌疫苗的研制现状

李文桂(LI Wen-gui)，陈雅棠

(重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所，重庆 400016)

人乳头瘤病毒16型； HPV16； 乳球菌； 疫苗； 综述

人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV16)是一类广泛感染人类上皮组织的小DNA病毒，能引起人体各种黏膜和皮肤的增生性疾病与肿瘤，与人宫颈癌的发生密切相关。疫苗接种是防治HPV16感染的有效途径之一，现有疫苗的种类包括死疫苗、减毒活疫苗、分子疫苗和DNA疫苗等，但存在一定的毒副作用，因此尚需研究新型HPV16疫苗。

乳球菌(Lactococcus)是一种能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的兼性厌氧革兰阳性菌。一般呈球形或卵圆形，大小为2 μm ×5 μm，单生，成对或成链状。模式菌株为乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。乳球菌通常具有加速食品酸化，增加食物营养及改善食物品质的作用，是乳制品工业发酵的重要菌类，是一种有希望的疫苗载体[1-2]。本文拟就乳球菌介导的HPV16的E7蛋白、E7-IL-12融合蛋白、E7mm蛋白和L1蛋白等疫苗的构建及其作用机制等方面的研制现状进行综述。

1 大肠埃希菌-乳球菌穿梭载体的构建

乳球菌的细胞壁厚且复杂，摄取外源DNA较为困难。Kim等[3]采用电穿孔方法进行外源DNA转化乳酸杆菌试验，摸索出了较好的转化条件,为构建重组乳球菌疫苗提供了有利条件。

为将外源DNA有效引入乳球菌，需构建大肠埃希菌-乳球菌穿梭表达载体，乳球菌的穿梭表达载体通常有组成型和诱导型2种类型。van等[4]构建的pMG36e是一种常见的组成型表达载体，它含有p32启动子及其下游部分的开放阅读框，来自pUC18的多克隆位点和来自PrtP基因的转录终止子，pWV01的复制子和氯霉素抗性基因等。尽管该载体可表达高水平的外源蛋白，但外源蛋白在细胞内的富集和聚合却可导致蛋白在胞质中被降解，通常对细胞具有毒害作用。

诱导型表达载体可利用诱导剂对外源蛋白进行可控性表达，应用较为广泛。de Rugter等[5]开发了乳菌肽控制的表达系统(Nisin-controlled expression system,NICE)，此系统包括3个组分：携带nisR和nisK基因的宿主菌、充当诱导分子的乳菌肽(Nisin)，以及含有nisA启动子的质粒。诱导剂Nisin诱导nisA启动子，nisA启动子由nisR和nisK组成的双组分调节系统进行调节。nisK是Nisin的膜结合感应蛋白，nisR是膜内反应调节子。nisK接受外源nisin肽信号后，自身磷酸化激活胞浆内nisR，随后nisR激活nisA启动子，启动下游基因的转录和表达。宿主菌NZ3900含有nisK和nisR基因，质粒pNZ8149含有nisA启动子，其起始密码子ATG处有NCOI酶切位点，这样使插入的目的基因与nisA启动子的核糖体结合位点区域构成翻译融合，较转录融合具有更高的表达活性。通常将含有nisA启动子的质粒导入携带nisR和nisK蛋白的宿主菌时，外源基因的表达较弱；而在对数生长期加入nisin进行诱导后，外源基因的表达水平在一定范围内与nisin的剂量成正比，诱导效率可以达到1 000倍以上[6]。

乳球菌的表达载体既可以利用胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，Thy)或丙氨酸消旋酶(alanine racemase,Alr)的营养缺陷型作为选择标记，也可以利用乳糖或木糖作为选择标记。这些标记均可食用，对于口服疫苗的开发极具价值。人们发现thyA基因编码的Thy在DNA合成中起关键作用，缺失thyA基因的菌株在普通培养基上不能生长，alr基因编码的Alr是许多细菌生长的必需成分。Fu等[7]以干酪乳杆菌来源的thyA基因作为选择标记，构建了食品级载体pFXL103。Bron等[8]将含异源alr基因的质粒pGIPO11转化到乳酸乳球菌alr-菌株后，alr-菌株恢复了野生型表型。Platteeuw等[9]构建了食品级穿梭表达载体pLP3537，其含有lacF选择标记、高拷贝内源性的乳酸乳球菌pSH71复制子、LacA启动子和PepN终止子，配套菌株为删除lacF基因的乳酸乳球菌NZ3900株，可以利用乳糖作为选择标记。将pLP3537质粒转入lacF基因缺失的宿主菌NZ3900株后，可使原来不能利用乳糖的宿主菌NZ3900发酵乳糖并产酸，使pH值降低，使筛选培养基中的溴甲酚紫由紫色变为黄色，此种利用乳糖作为选择标记表达系统的元件均是食品级的，口服安全。Gosalbes等[10]构建了乳糖调节的乳酸杆菌食品级表达载体pILac。戊糖乳球菌的MD353染色体上含有木糖(xylose，xy1)编码基因，可以发酵木糖。Posno等[11]把xy1基因插入pLP3537，得到食品级表达载体pLP3537-xyl，可以利用木糖作为选择标记。上述选择标记的成功开发为发展乳球菌成为疫苗载体提供了有力保障。

2 E7蛋白重组乳球菌疫苗

HPV16基因组分为早期区(E区)和晚期区(L区)，E区又分为E1～E7区，其中E7基因编码E7蛋白。E7蛋白是一种DNA结合蛋白，可干扰抑癌蛋白RB与转录因子E2F和P107的结合，使细胞周期发生紊乱，E7蛋白还可与P103、Cyclin A和CDK2等细胞周期相关因子结合，使细胞发生癌变。核酸内切酶A(nuclease A，NucA)是一种外源信号肽，LEISSTCDA肽段是一种连接短肽，它们均可促进外源蛋白的分泌。Cortes-Perez等[12]将pBS-E7与pVE5547重组得pIL-E7-CWA，将其电穿孔转化乳酸乳球菌NZ9000株，10 ng/mL乳菌肽诱导1 h，免疫印迹发现HPV16患者的血清识别分子量为32 KDa的E7-CWAM6融合蛋白；将1×109CFU疫苗滴鼻免疫C57BL/6鼠，在初次免疫后14和28 d加强2次，在初次免疫后35 d采集免疫鼠的血清，免疫印迹证实该血清可识别重组E7-GST融合蛋白，说明该疫苗可诱导小鼠产生有效的体液免疫应答。

Ribelles等[13]以pSEC-E7为模板扩增383 bp的E7编码基因，插入pGEP-CBD得pE7-CBD；将其电穿孔转化乳酸乳球菌NZ9000株，10 ng/mL乳菌肽诱导1 h，SDS-PAGE证实重组菌表达分子量为37 KDa的E7-CBD融合蛋白，免疫电镜提示重组菌的表面存在E7-CBD融合蛋白分子；将1×108CFU疫苗滴鼻免疫C57BL/6鼠，初次免疫后14、28 d各加强1次，初次免疫35 d后发现免疫鼠的脾内E7特异的细胞毒T淋巴细胞的数目显著增多；末次免疫后1周用1×105CFU的肺癌细胞株TC-1皮下注射进行攻击，在攻击后3周发现60%(3/5)的免疫鼠末发生肿瘤，40%(2/5)的免疫鼠出现体积为0.285 cm3的肿瘤，而对照组的肿瘤体积为2.939 cm3，表明该疫苗可有效对抗肺癌细胞株TC-1的攻击。

研究[14-17]表明，以pCD-E7为模板扩增大小为313 bp的E7编码基因，插入pGEM-Teasy获得pGEM-E7，与pVE8001重组获得pBS-E7；将pGEM-E7与pSEC-Nuc重组获得pSEC-E7，将NucA基因插入pSEC-E7获得pSEC-Nuc-E7；将pBS-E7与pSEC-LEISSTCDA重组获得pSEC-LEISSTCDA-E7，与pBS-Nuc重组获得pSEC-LEISSTCDA-Nuc-E7；将pCYT-E7与pVE5546重组获得pILCYT-E7，与pGK重组得pCWA-E7；分别将pSEC-E7、pSEC-Nuc-E7、pSEC-LEISSTCDA-Nuc-E7和pCWA-E7这4种质粒电穿孔转化乳酸乳球菌NZ9000株，1 ng/mL乳菌肽诱导1 h，SDS-PAGE证实4种重组菌分别表达19 KDa的E7蛋白、35KDa的Nuc-E7融合蛋白、41KDa的LEISS-Nuc-E7融合蛋白,以及38KDa的E7-CWAM6融合蛋白。免疫印迹发现，HPPV16患者血清识别重组菌表达的LEISS-Nuc-E7融合蛋白，免疫荧光表明4种重组菌表面存在相应的融合蛋白分子。将1×109CFU的疫苗滴鼻免疫C57BL/6鼠，初次免疫后14和28 d各加强1次，末次免疫后1周发现免疫鼠的脾细胞分泌高水平的IL-2和IFN-γ等细胞因子，提示这4种疫苗可诱导小鼠产生TH1型的免疫应答。

随后将1×109CFU的LL-E7疫苗加1×109CFU的LL-IL-12佐剂疫苗滴鼻免疫C57BL/6鼠，初次免疫后14、28 d各加强1次，在末次免疫后1周发现免疫鼠的脾内细胞毒T淋巴细胞、CD4+和CD8+T细胞的数目显著增加；末次免疫后1周皮下注射5×104CFU的肺癌细胞株TC-1进行攻击，攻击后5周发现50%(12/24)的免疫鼠末发生肿瘤，可持续100 d，50%(12/24)的免疫鼠出现体积为1 cm3的肿瘤，而对照组的肿瘤体积可达6 cm3。将10只无瘤的免疫鼠喂养3个月后再用TC-1细胞株进行攻击，攻击后6月仍未发生肿瘤，提示该类疫苗加用IL-12佐剂可明显对抗肺癌细胞株TC-1的攻击感染。将5×104CFU的肺癌细胞株TC-1皮下注射C57BL/6鼠，注射后7 d小鼠出现可触诊的肿瘤，此时用1×109CFU的LL-E7疫苗和1×109CFU的LL-IL-12佐剂疫苗对模型鼠混合滴鼻进行免疫治疗，免疫治疗后14、18 d各加强1次，发现35%(8/24)免疫治疗鼠的肿瘤消退，可持续100 d，65%(16/24)免疫治疗鼠的肿瘤体积缩小为1.8 cm3，而对照组的肿瘤体积可达7.5 cm3，表明该类疫苗加用IL-12佐剂对肺癌细胞株TC-1模型鼠具有较好的免疫治疗作用。

3 E7-IL-12融合蛋白重组乳球菌疫苗

白细胞介素12(interleukin 12，IL-12)可促进NK细胞和T细胞增殖，提高它们的杀伤活性，诱导IFN-γ产生，促进TH0细胞分化为TH1细胞，促进IgG2a、IgG2b和IgG3合成，抑制IgG1合成。Li等[18]分别以pCD-E7和pORT-IL-12为模板扩增E7蛋白和IL-12的编码基因，将E7基因插入pMG36e获得pMG36e-E7，将IL-12基因插入pMG36e-E7获得pMG36e-E7-IL-12；将其电穿孔转化乳酸乳球菌NZ3900株，1 ng/mL乳菌肽诱导3 h，SDS-PAGE证实重组菌表达分子量为89 KDa的E7-IL-12融合蛋白。将1×109CFU疫苗滴鼻免疫C57BL/6鼠，初次免疫后14、28 d各加强1次，初次免疫35 d后发现免疫鼠的血清IL-12和IFN-γ等细胞因子的水平升高，脾内E7特异的细胞毒T细胞的数目显著增多；末次免疫后1周皮下注射5×104的肺癌细胞株TC-1进行攻击，攻击后5周发现37.5%(3/8)的免疫鼠未发生肿瘤，62.5%(5/8)的免疫鼠出现体积为0.89 cm3的肿瘤，而对照组的肿瘤体积可达7.84 cm3，说明该疫苗可有效对抗肺癌细胞株TC-1的攻击。将5×104CFU的肺癌细胞株TC-1皮下注射小鼠，注射后7 d小鼠出现可触诊的肿瘤，此时用1×109CFU疫苗对模型鼠滴鼻进行免疫治疗，治疗后14、21 d各重复1次，初次免疫治疗后90 d发现25%(2/8)治疗鼠的肿瘤消退，75%(6/8)治疗鼠的肿瘤体积明显缩小，而对照组小鼠的肿瘤体积增大，在50 d内全部死亡，提示该疫苗对肺癌细胞株TC-1模型鼠具有较好的免疫治疗作用。

4 E7mm蛋白重组乳球菌疫苗

E7蛋白是一种致癌蛋白，改变E7蛋白内的2个C-X-X-C基序，可产生一种不稳定的蛋白，命名为E7 mm蛋白。研究发现，E7mm蛋白的转染活性明显下降，比天然E7蛋白具有更好的免疫原性。Cortes-Perez等[19]以pBC209-E7mm为模板扩增E7mm蛋白的编码基因，插入pVE5547获得pILCWAM6-SPUSP45-E7mm，与pGK重组获得pCWAM6-SPUSP45-E7mm；将其电穿孔转化乳酸乳球菌NZ9000株，25 ng/mL乳菌肽诱导5 h，SDS-PAGE证实重组菌表达分子量为38 KDa的SPUSP45-E7-CWAM6融合蛋白；免疫荧光发现重组菌的表面含有融合蛋白分子，但未进行保护力的试验。

5 L1蛋白重组乳球菌疫苗

HPV16基因组的L1基因可编码L1蛋白，它是主要衣壳蛋白，可自身聚合成病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)。Cortes-Perez等[20]以pCD-L1为模板扩增1 606 bp的L1蛋白编码基因，插入pCR-TOPO获得pCR-L1，与pSEC-E7重组获得pSEC-L1；将其电穿孔转化乳酸乳球菌NZ9000株，1 ng/mL乳菌肽诱导1 h，SDS-PAGE证实重组菌表达分子量为60 KDa的PreL1蛋白；免疫电镜显示重组菌的表面存在直径30～50 nm的VLPs。

Cho等[21]以pGEM-L1为模板扩增L1蛋白的编码基因，插入pAM399获得pAMJ399-L1；将其电穿孔转化乳酸乳球菌MG1363株，培养1 h，SDS-PAGE证实重组菌表达分子量为57 KDa的L1蛋白；将1010CFU疫苗口服免疫BALB/c鼠，初次免疫后2、4周各加强1次，初次免疫后9～12周发现免疫鼠的血清IgG升高，初次免疫后9周达较高水平(滴度1∶5 000)，阴道SIgA抗体无明显变化；同时将1010CFU疫苗口服免疫BALB/c鼠，初次免疫后1、14、15、28和29 d各加强1次，初次免疫后9～12周发现免疫鼠的血清IgG升高，初次免疫后9 W达较高水平(滴度1∶900)，阴道SIgA抗体无明显变化，说明该疫苗可诱导小鼠产生有效的体液免疫应答。

6 结语

重组乳球菌疫苗具有下述优点：它是一种发酵工业长期使用的食品级益生菌，是一种公认为安全(generally regarded as safe,GRAS)的微生物，易培养，基因操作简便、可靠，转化效率高、重复性好。乳球菌是一种革兰阳性菌，不分泌内毒素，表达的外源蛋白不需纯化，可连同菌体直接服用。乳球菌通常不产生细胞外蛋白酶，不会在细胞外对分泌的外源蛋白进行降解；通常较少分泌自身蛋白，减少了载体自身蛋白对分泌的外源蛋白的干扰，外源蛋白既可在细胞内表达，也可在细胞壁进行表达，还可以分泌到细胞外进行表达；乳球菌不在胃肠道定植，很少产生免疫耐受。乳酸菌的伴随抗原是一种免疫佐剂，可提高重组乳球菌疫苗诱导的免疫应答；乳酸菌与微颗粒疫苗的大小相似，可将抗原递呈给肠黏膜组织的M细胞，诱导免疫应答。口服或滴鼻接种重组乳球菌疫苗可诱导宿主产生较强的黏膜免疫应答和系统性免疫应答。

重组乳球菌疫苗具有下述缺点：目前大部分乳球菌的表达载体常含有非食品级的基因片段，这将给乳球菌作为活菌微生态制剂带来安全隐患；尚未阐明重组乳球菌疫苗诱导小肠黏膜产生免疫应答的机制，尚未阐明重组乳球菌疫苗的表达调控机制，长期口服重组乳球菌疫苗并不能在宿主体内表达足量的抗原，长期低剂量口服重组乳球菌疫苗有可能诱导免疫耐受，重组乳球菌疫苗的效果评价仅限于体外试验和动物试验阶段。

随着分子生物学和分子免疫学技术的发展，进一步筛选高表达能力的菌株可提高外源蛋白的表达水平。针对不同的蛋白表达方式采用不同的免疫途径，可提高重组乳球菌疫苗诱导的免疫应答。深入研究重组乳球菌疫苗分泌外源蛋白的调控机制；构建安全、高效的食品级表达载体；准确定位外源蛋白在重组乳球菌疫苗中的表达位置，使重组抗原与黏膜的免疫系统充分接触；实时定量检测重组乳球菌疫苗在宿主胃肠道表达的目的蛋白；合理控制重组乳球菌疫苗在胃肠道的存活时间，避免免疫耐受；开发合适的免疫佐剂，加强重组乳球菌疫苗诱导的免疫应答，阐明上述问题，重组乳球菌疫苗用于HPV16感染的免疫预防指日可待。

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(本文编辑：左双燕)

Research of recombinant vaccine of human papillomavirus type 16 mediated byLactococcus

(CHEN Ya-tang)

(Institute of Infectious and Parasitic Diseases, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

2016-01-09

国家自然科学基金项目(No.30801052、No.30671835、No.30500423和No.30200239)

李文桂(1967-)，男(汉族)，湖北省郧县人，研究员，主要从事病原微生物的分子生物学和分子免疫学研究。

李文桂 E-mail：cqliwengui@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.10.021

R183

A

1671-9638(2016)10-0802-05