中东呼吸综合征冠状病毒的实验室检测以及疫苗和治疗研究进展

卢帅 秦堃 谭文杰

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所卫生和计划生育委员会医学病毒学与病毒病重点实验室

·综述·

中东呼吸综合征冠状病毒的实验室检测以及疫苗和治疗研究进展

卢帅 秦堃 谭文杰

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所卫生和计划生育委员会医学病毒学与病毒病重点实验室

中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS⁃CoV）是2012年首次发现的具有高病死率、可感染人的一种新型冠状病毒，给全球公共健康带来严重威胁。目前，针对中东呼吸综合征冠状病毒的病毒分离、免疫学及核酸检测方法已经建立，特异性的疫苗和治疗药物也正在研发之中，成为控制MERS⁃CoV感染蔓延的有力武器。本文就MERS⁃CoV的实验室检测及疫苗和治疗研究进展作一综述，以期为MERS⁃CoV的防控提供参考。

Fund program：Mega Project for Infectious Disease Research of China（2014ZX10004001）

中东呼吸综合征冠状病毒是2012年从沙特阿拉伯一位因急性肺炎伴肾功能衰竭而死亡的患者呼吸道上皮细胞中分离的一种新型冠状病毒［1］。该病毒首先在沙特阿拉伯发现后，迅速向中东其他国家蔓延，随后在埃及、突尼斯、法国、德国、英国、韩国、中国等全球27个国家都有了感染病例的报道。自2012年9月疫情爆发到2016年5月16日，WHO共收到全球1733例实验室确诊感染MERS⁃CoV的病例报告，其中628例死亡，病死率达36%，远高于发生在2003年的严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS⁃CoV）［2］。MERS⁃CoV的高病死率及快速蔓延，使其成为全球公共健康的严重威胁。

冠状病毒（Coronavirus，CoV）属巢式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，为有包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长27⁃32kb，是目前已知最大的RNA病毒。国际病毒学分类委员会（International committee on taxonomy of viruses，ICTV）将冠状病毒分为α、β、γ、δ 4个病毒属，其中MERS⁃CoV为β属，系统进化树分析其与蝙蝠冠状病毒BtCoV⁃HKU4、BtCoV⁃HKU5遗传关系接近，并且有报道其可能源于中东地区的单峰骆驼［3］。MERS⁃CoV基因组全长约30kb，5′和3′端各有一个非编码区，距5′端2／3区域包含两个重叠的开放阅读框（OpeningReading Frame，ORF）：ORF1a和ORF1b，主要负责编码与病毒复制相关的酶类等非结构蛋白；而3′端1／3区域主要负责编码棘突蛋白（Spike，S）、膜蛋白（Membrane，M）、小膜蛋白（Envelpoe，E）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）等四种结构蛋白［4］。

目前已知能导致人类感染的冠状病毒有HCoV⁃229E、HCoV⁃OC43、SARS⁃CoV、HKU1、HCoV⁃NL63和MERS⁃CoV。其中MERS⁃CoV是继SARS⁃CoV之后的又一高致死率的冠状病毒，也受到全球越来越多的关注，因此快速准确的诊断及安全有效的疫苗药物对控制MERS⁃CoV感染十分关键。通常认为病毒分离培养是实验室诊断的金标准，但MERS⁃CoV的培养较为特殊，不仅依赖较为敏感的细胞系，且需在生物安全三级（Biosafety Level⁃3，BSL⁃3）实验室操作，这对MERS⁃CoV的病毒培养产生了一定的局限性。目前，临床尚无对MERS⁃CoV有效的疫苗或特异性治疗药物。但对MERS⁃CoV的实验室检测方法在不断优化，安全有效的疫苗和药物也在不断研究。本文就MERS⁃CoV的实验室检测方法及疫苗、药物研究进展进行综述。

1 MERS⁃CoV的实验室检测

1.1 MERS⁃CoV的抗体检测血清学方法主要是检测血清中的MERS⁃CoV结构蛋白特异性抗体，可以用来评价冠状病毒的血清流行病学、追踪其传播途径进行溯源，也可以用来监测感染和疾病的进展。MERS⁃CoV感染者的血清中抗体主要为IgM和IgG，其中IgM一般认为主要出现在感染早期阶段，而IgG抗体可在感染后长期存在，WHO对血清学阳转的诊断标准是恢复期血清抗体滴度是急性期的4倍或以上，因此对MERS⁃CoV感染的抗体检测主要针对的是IgG。研究者们已建立了一系列检测方法，常见如免疫荧光（Immunoflurescence assay，IFA）、酶联免疫吸附实验（Enzyme⁃linked immunosorbent assay，ELISA）、蛋白印记（Western blot，WB）、蛋白芯片方法（Protein microarray）和假病毒中和实验（Pesudoparticle neutralization test，ppNT）、微量中和实验（Micro neutralization test，MNT）等。

血清学检测方法最大的问题是假阳性和假阴性，Chan KH等通过IFA筛查并用中和抗体实验验证发现，SARS患者血清中存在MERS⁃CoV的中和抗体［5］，提示了这种方法可能出现的假阳性。同时IFA方法对荧光显色的判断具有主观差异，难以标准化操作，整个诊断程序较为复杂，不适合高通量的检测。而Corman等利用RT⁃PCR对MERS⁃CoV感染者拭子标本进行核酸检测时呈现阴性，但IFA方法却在患者血清中检出抗体［6］，表明IFA可以作为其他检测方法的补充。

ELISA检测方法则是以裂解的病毒或重组蛋白作为抗原，来检测血清中的抗体。通常认为ELISA检测方法的敏感性较高，在对确诊SARS⁃CoV感染的患者实验中被证实阳性率达85%⁃100%，与IFA比较具有相当的敏感性。而在不同的病例对照研究中发现IFA和基于病毒抗原的ELISA对SARS⁃CoV的诊断存在0%⁃12.2%的假阳性率［7］。尤其是对一些在系统进化上较为接近的冠状病毒，就要考虑到ELISA反应的特异性问题。N和S蛋白作为冠状病毒主要的结构蛋白，其中N蛋白在病毒含量高，但相对保守，SARS–CoV N全长基因与OC43、HKU1、MERS⁃CoV N基因的核苷酸同源性分别为34.2%、33.0%和46.7%［7］，因此在血清学检测N抗体时交叉反应较强。Woo等在研究基于SARS⁃CoV N蛋白的ELISA检测时，发现与基于S蛋白的WB确诊实验相比有87.9%的假阳性［8］，同时也有报道称基于N蛋白的SARS⁃CoV检测与其他人冠状病毒存在较强的交叉反应［9］。Al⁃Abdallat等利用与MERS⁃CoV较为接近的BtCoV⁃HKU5.2 N蛋白的ELISA初筛血清抗体，再用IFA和MNT实验来检测MERS⁃CoV特异抗体［10］。在对密接人群的血清学筛查中，Buchholz等建立了两步检测方法，利用病毒感染细胞的IFA作为初筛，以中和实验作为确诊，表现出很好的效果［11］。

Prrera等构建了MERS⁃CoV假病毒对人和单峰驼血清进行了检测，发现ppNT与传统的MNT方法检测骆驼血清MERS⁃CoV抗体的阳性率分别为98.2%和93.6%，二者表现出很好的相关性，但均不能排除MERS⁃CoV相近毒株的交叉反应［12］。但是ppNT检测MERS⁃CoV的方法无需在生物安全三级实验室操作，适合大规模的血清流行病学研究。也有报道利用正确折叠和糖基化的S1片段制成的蛋白芯片来检测MERS⁃CoV，结果显示与其他人冠状病毒感染血清均无假阳性［13］。这种方法需要样本少，可用干燥血点来检测，是一种快速、简便、高通量的检测方法。

1.2 MERS⁃CoV的抗原检测MERS⁃CoV的抗原检测主要是针对人或动物感染标本如拭子等，来确定病毒在组织中的含量。Song D等利用多肽作为免疫原，筛选杂交瘤细胞获得了特异性N蛋白鼠单抗，制备了针对MERS⁃CoV N抗原的胶体金快速检测试纸条，并对单峰驼鼻拭子标本进行检测，证明与针对upE、ORF1a的RT⁃PCR方法表现出较高的一致性［14］。此外，针对MERS⁃CoV N抗原的双抗体夹心ELISA方法也由Chen Y等建立，其病毒检测限可达10 TCID50／0.1 ml，同时证明与其他人冠状病毒和流感病毒、腺病毒等都无交叉反应［15］。Yamaoka Y等利用小麦胚芽无细胞蛋白表达系统制备了MERS⁃CoV N抗原及鼠单克隆抗体，建立了双抗体夹心的ELISA和胶体金检测方法［16］，具有很好的敏感性和特异性，这些方法都有望用于人群或骆驼MERS⁃CoV感染的检测。但是，由于临床样本中MERS⁃CoV的排毒规律不清楚，选取合适的标本和采样时间对提高检出率十分重要。

1.3 MERS⁃CoV的核酸检测对MERS⁃CoV的分子学检测方法包括real time RT⁃PCR和反转录环介导等温扩增（Reverse transcription loop⁃mediated isothermal amplification assays，RT⁃LAMP）等。根据MERS⁃CoV基因组结构（HCoV⁃EMC／2012，JX869059），RT⁃PCR的目的基因可包括：upE、ORF1a、ORF1b、RdRp和N基因。Corman等建立了upE与ORF1b为靶标的实时荧光定量RT⁃PCR方法，其中upE基因作为筛查基因，而ORF1b基因作为确诊的目的基因，upE为目的基因的RT⁃PCR可检测低至3.4拷贝／反应的RNA，而ORF1b最低检测限只能达到64拷贝／反应，这种方法组合具有很好的特异性，在检测其他呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等都表现出阴性［17］，具有很好的诊断性能。国内也有对MERS⁃CoV核酸检测方法优化的报道［18］。Lu X等从全长N基因中选出两段N2（29424⁃29442 bp）和N3（28747⁃28771 bp），把upE和N2作为筛查的目的基因，而N3作为确诊的目的基因，这种方法证明具有很好的敏感性和特异性。对MERS⁃CoV RNA最低检测限可达10拷贝／反应，具有很好的特异性，并且对其他呼吸道病毒以及人冠状病毒都能很好地区分［19］。Chan JF等针对冠状病毒的先导序列的实时定量RT⁃PCR检测拭子标本发现，检测限可达5 RNA拷贝／反应［20］。

鉴于RT⁃PCR方法的温度循环依赖性，不适合现场操作，简便的等温扩增技术逐渐发展起来。Kazuya等利用RT⁃LAMP靶向针对N基因保守区段的扩增反应，检测MERS⁃CoV用时不超过1小时，且检出低限可达3.4 RNA拷贝每反应［21］。Sanchita等利用RT⁃LAMP扩增MERS⁃CoV ORF1a，ORF1b和upE基因，检测限为0.02到0.2 PFU每反应，对细胞培养上清中MERS⁃CoV的检测只需30⁃50 min，且与其他呼吸道病毒无交叉［22］。关丽等对RT⁃LAMP进行优化，建立了基于浊度仪和颜色变化的简单、快速的RT⁃LAMP［23］，虽然检测限低于RT⁃PCR，但操作简单、耗时短、非温度循环依赖，相比RT⁃PCR更为方便快速。但是RT⁃PCR或RT⁃LAMP也有一定的局限性，尤其是在病毒逃逸及标本如拭子RNA提取方法不当时，检出率会降低。同时RT⁃PCR方法的特异性也会因其他RNA的污染而受到干扰，这与SARS⁃CoV等其他RNA病毒检测遇到的问题是一样的。

2 MERS⁃CoV的疫苗研究

MERS⁃CoV的S蛋白是介导病毒颗粒与细胞膜融合的结构蛋白，能诱导中和抗体产生。通常S蛋白可被切割成两个部分S1和S2，其中S1介导病毒的附着，S2介导膜融合［24］。对MERS⁃CoV S蛋白的结构研究显示，其S1区段有重要的受体结合区RBD，其主要与细胞表面受体二肽基肽酶4（Dipeptidyl peptidase 4，DDP4）结合，从而介导病毒的入侵［25］。目前尚无对人或动物有效的MERS⁃CoV疫苗，科学家们进行疫苗研究关注的主要是S蛋白。Volz A等利用表达MERS⁃CoV S全长的改良型痘苗病毒安卡拉株MVA免疫小鼠［26］，Coleman等用杆状病毒表达的S蛋白颗粒加佐剂免疫小鼠［27］，能诱导小鼠产生中和抗体，并具有保护作用。Du L等发现S蛋白377⁃662位氨基酸能诱导小鼠中和抗体的产生［28］，此区域正是受体结合区域，提示可作为MERS⁃CoV疫苗研究的靶标。Mou H等利用带有人IgG Fc段的受体结合区（Receptor binding domain，RBD）（S，377⁃588aa）重组蛋白免疫兔子，发现能诱导产生很高的中和抗体［29］；Du L等发现截短的RBD（S，377⁃588aa）蛋白能抑制小鼠感染MERS⁃CoV，并能产生很强的中和抗体［30］。Lan J等利用不同的佐剂在小鼠模型实验研究中也发现RBD亚单位疫苗具有较好的保护效果［31］，在恒河猴模型中也发现RBD亚单位疫苗能起到部分保护效果［32］。而Wang L等用包含MERS⁃CoV S全长的DNA疫苗证明了其在小鼠和恒河猴模型中的良好的保护效果［33］。Wang C等利用杆状病毒表达系统制备了MERS⁃CoV病毒样颗粒（Virus like particles，VLPs），并在恒河猴模型中证明具有较好的保护效果［34］。此外还有MERS⁃CoV S蛋白表位多肽疫苗，并在小鼠体内证明能够诱导较高的体液和细胞免疫应答水平［35］。

3 MERS⁃CoV的抗病毒药物研究

目前，临床上尚无针对MERS⁃CoV感染的特异性治疗药物，MERS⁃CoV的治疗多依赖于广谱的抗病毒及支持治疗，但一些特异性的药物展现出良好的应用前景。Falzarano等用α干扰素（Interferon⁃α，IFN⁃α）和利巴韦林联合治疗恒河猴MERS⁃CoV感染模型，发现能降低病毒复制，起到一定的延缓病情作用，而在人体身上采用上述联合治疗，对部分患者可能有效［36］。Omrani等对MERS⁃CoV患者的队列研究发现，联合治疗可部分改善MERS⁃CoV感染患者生存率［37］。可见，IFN联合利巴韦林对MERS⁃CoV的治疗作用有限。在对MERS⁃CoV感染的特异靶标药物的研究发现，MERS⁃CoV在膜融合过程中S2区段的七肽重复区HR1和HR2的融合是十分关键的。以此为靶点，设计了类似于HR2的多肽抑制剂，在体外实验证明可抑制病毒的膜融合与入侵［38］。Channappanavar等设计了HR2多肽类似物HR2P⁃M2，并在MERS⁃CoV感染的动物模型中展示了较好的效果［39］。此外，抗体治疗也有很大进展。许多MERS⁃CoV S单抗都表现出很好的中和活性，全人源的单抗有望作为较为安全的治疗药物进入临床［40］。

MERS⁃CoV作为严重威胁全球公共健康的病毒，快速准确的实验室检测和安全有效的治疗药物是控制其蔓延的关键。目前，实验室检测方法多样，对于不同病例、不同病程的患者，选择合适的采样部位、样本及检测手段对准确的诊断十分重要。MERS⁃CoV病死率高，危害大，但目前临床尚无有效药物。因此，对MERS⁃CoV检测方法的优化及特异性疫苗药物的开发仍是应对MERS所面临的重要工作。

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Development of laboratory diagnosis，vaccines and therapies for the Middle East respiratory syndrome coronavirus

Lu Shuai，Qin Kun，Tan Wenjie

Key Laboratory of Medical Virology，National Health and Family Planning Commission，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China（Lu S，Qin K，Tan WJ）

The Middle East respiratory syndrome coronavirus，firstly detected in 2012，was a novel coronavirus causing high mortality to humans，which posed a severe threat to public health.Presently，laboratory methods for virus isolation and diagnosis were built，as well as the development of vaccines and drugs for the MERS⁃CoV，which will be a powerful weapon to control its spread.This review summarizes recent advances on laboratory diagnosis，vaccines and therapies for MERS⁃CoV，which might provide implications for the prevention and control of this serious disease.

Middle East respiratory syndrome coronavirus；Diagnosis；Vaccine；Therapy

谭文杰，E⁃mail：tanwj28＠163.com

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

中东呼吸综合征冠状病毒；检测；疫苗；治疗

传染病防治重大专项（2014ZX10004001）

2016⁃05⁃18）