高血压大鼠血脑屏障紧密连接变化与脑白质病变的相关性

张　彦　崔　怡　董运芳

(河北医科大学第三医院，河北　石家庄　050011)



高血压大鼠血脑屏障紧密连接变化与脑白质病变的相关性

张彦崔怡1董运芳1

(河北医科大学第三医院，河北石家庄050011)

〔摘要〕目的探讨高血压大鼠血脑屏障紧密连接变化与脑白质病变的可能关系。方法取健康清洁级雄性Wistar大鼠60只，随机分为假手术组、模型4、8、12、20、30 w组，每组10只。监测血压，进行脑白质病变分级，电镜下观察白质区血脑屏障结构，免疫荧光法检测脑组织白蛋白渗出情况，Loyez染色法观察神经纤维变化。结果术后各模型周组大鼠血压均明显高于同期假手术组(P<0.05)；其中模型组大鼠术后4、8 w血压与术前相比血压明显升高，而术后12、20、30 w血压趋于平稳。模型组大鼠术后8 w起胼胝体病变逐渐加重，之后尾核、内囊、外囊受累病变明显加重，术后20 w时胼胝体病变分级明显高于之前(P<0.05)。模型12 w组25个毛细血管内皮细胞紧密连接中有7个连续性中断，基底膜厚度增加；模型20 w组22个毛细血管内皮细胞紧密连接中有8个连续性破坏，细胞出现明显肿胀，胞内出现空泡样病变；模型30 w组19个毛细血管内皮细胞紧密连接中有10个出现中断。模型20 w组大鼠胼胝体存在可吞噬白蛋白的胶质细胞；模型30 w组大鼠存在颗粒状白蛋白渗出，分布于脑实质中，以胼胝体、尾核渗出最为明显。假手术组和模型4 w组大鼠的Loyez神经纤维排列整齐；模型8 w组大鼠的Loyez神经纤维排列出现紊乱；模型12 w组可见空泡样改变；模型20 w可见脑白质出现明显疏松，神经纤维断裂；模型30 w组脑白质疏松更为明显。结论持续高血压状态会损伤血脑屏障的毛细血管内皮细胞紧密连接，进而使血浆白蛋白渗出，引起神经毒性，导致脑白质病变的发生。

〔关键词〕高血压性脑白质病变；血脑屏障

1河北医科大学

第一作者：张彦(1970-)，女，主管护师，主要从事脑血管病教学护理及辅助治疗研究。

据统计，健康老年人群中约有14.2%的人存在脑白质病变的趋势〔1〕。高龄和高血压均为脑白质病变重要的危险因素〔2〕，其中高血压为可干预的影响因素。研究显示，血脑屏障受损可能与脑白质病变有关，但其具体的作用机制尚不十分清楚〔3〕。本研究旨在探讨高血压引发的毛细血管内皮细胞紧密连接损伤与高血压性脑白质病变的相关性。

1材料与方法

1.1实验动物健康雄性清洁级Wistar大鼠60只，体重70～100 g，由广西医科大学医学实验动物中心提供，合格证号：桂检字(2003)：第0005，严格按照《实验动物伦理审查指南》进行。随机分为假手术组、模型4、8、12、20、30 w组，每组10只。

1.2模型建立和血压测量根据已定型的双肾双夹法复制易卒中型肾血管性高血压大鼠；假手术组采取未钳位夹肾动脉。在不同时间点使用BP-2000型大小鼠无创血压计(上海玉研科学仪器有限公司)经尾动脉测定大鼠收缩压。

1.3脑白质病变分级使用10%的水合氯醛麻醉大鼠，剂量为400 mg/kg，经左心室向主动脉插管，剪开右心房，迅速灌注150 ml生理盐水，至右心房流出无血澄清液体后使用4%多聚甲醛300 ml联合0.1 mmol/L 磷酸缓冲液固定脑组织，开颅将脑组织取出后固定1 h，梯度蔗糖溶液脱水；包埋后置于冷冻切片机切片并进行HE染色。置于光学显微镜下观察脑白质病变情况，病变分级标准为0级：正常；Ⅰ级：神经纤维相互缠绕；Ⅱ级：有明显空泡样改变；Ⅲ级：髓鞘的神经纤维消失。

1.4毛细血管内皮细胞紧密连接观察按照1.3的方法开颅取脑，取出脑白质胼胝体后立即放于固定液中。根据电镜操作标准过程制作超薄切片、半薄切片，铀铅双染后加速电压90 kV条件下使用日立H-7650型透射电子显微镜观察血脑屏障超微结构的变化情况。

1.5脑白质白蛋白渗出检测采取间接免疫荧光法检测，先于枸橼酸中修复抗原，在室温条件下于兔血清中孵育1.5 h。将血清吸干后滴加稀释过的绵羊白蛋白抗体，置于4℃环境中孵育过夜。用0.1 mmol/L磷酸缓冲液洗净后，滴加兔抗绵羊二抗，避光条件下孵育1 h，洗净后使用抗荧光淬灭封片液进行封片，置于荧光显微镜下观察并拍照。

1.6Loyez神经纤维染色将冰冻切片置于4%铁明矾溶液1 d，蒸馏水洗5～10次，使用新配置碳酸锂苏木素染液浸染1 d，置于1%盐水乙醇分化20 s，流动水清洗至返蓝为止。梯度酒精脱水，二甲苯透明，封固后置于光学显微镜下观察。

1.7统计学方法应用SPSS11.0软件进行t检验和方差分析。

2结果

2.1易卒中型肾血管性高血压大鼠血压监测情况术前两组大鼠血压之间无差异(P>0.05)；术后4、8、12、20、30 w时模型组大鼠血压均明显高于同期假手术组大鼠血压(P<0.05)；其中模型组大鼠术后4、8 w血压与术前相比血压明显升高，而术后12、20、30 w血压趋于平稳。见表1。

表1　易卒中型肾血管性高血压大鼠不同时间点血压变化情况±s,n=10,mmHg)

与假手术组比较：1)P<0.05；与同组术前比较：2)P<0.01

2.2脑白质病变分级情况模型组大鼠脑白质病变分级随时间延长逐渐加重，术后4 w起模型组大鼠胼胝体、尾核、内囊、外囊开始出现轻微病变，术后8 w起胼胝体病变逐渐加重，之后尾核、内囊、外囊受累病变明显加重，术后20 w时胼胝体病变分级明显高于之前(P<0.05)。另外3个区域各时间点与之前相比均无明显改变(P>0.05)。见表2。

表2　不同时间点脑白质病变分级情况±s,n=10)

与模型20 w组比较：1)P<0.05

2.3血脑屏障超微结构观察假手术组大鼠毛细血管内皮细胞间吻合、连接完整，血管形态平滑。模型4 w组和8 w组相邻内皮细胞紧密连接中连续且吻合紧密；模型12 w组25个毛细血管内皮细胞紧密连接中有7个连续性中断，基底膜厚度增加；模型20 w组22个毛细血管内皮细胞紧密连接中有8个连续性破坏，细胞出现明显肿胀，胞内出现空泡样病变；模型30 w组19个毛细血管内皮细胞紧密连接中有10个出现中断。

2.4脑白质白蛋白渗出检测模型4、8、12 w组大鼠脑实质和血管周围未发现有血浆白蛋白渗出；模型20 w组大鼠胼胝体存在可吞噬白蛋白的胶质细胞，血管附近存在增强的白蛋白荧光；模型30 w组大鼠存在颗粒状白蛋白渗出，分布于脑实质中，以胼胝体、尾核渗出最为明显，血管周围白蛋白渗出少于之前。

2.5Loyez神经纤维染色结果假手术组和模型4 w组大鼠的Loyez神经纤维排列整齐；模型8 w组大鼠的Loyez神经纤维排列出现紊乱；模型12 w组可见空泡样改变；模型20 w组可见脑白质出现明显疏松，神经纤维断裂；模型30 w组脑白质疏松更为明显。见图1。

图1　神经纤维染色观察(×200)

3讨论

自发性高血压易卒中大鼠模型来源较少，高昂的成本限制了其使用〔4〕。易卒中型肾血管性高血压大鼠多用于脑中卒相关研究，但该模型也适用于脑白质病变的研究，首先建模过程与人体慢性高血压性脑白质病变发的发病过程相似的较高，其次病理切片显示病情发展过程中出现的脑白质疏松、神经纤维缺失等病理改变与脑白质病变的病理改变一致〔5〕。本次研究中胼胝体为模型组大鼠病变最显著的部位，与双侧颈动脉狭窄模型一致，原因主要为胼胝体供血的血管来源于豆纹动脉终末支，同源自大脑表面的血管间吻合度较差，当出现低灌注时胼胝体易出现缺血性改变。脑白质病变发病中高血压和高龄为两个主要的危险因素。高血压患者的脑血管阻力提升、血管自动调节能力降低与脑白质病变的严重程度密切相关〔6〕。本研究结果支持高血压与脑白质病变存在明显关联，能够促进其发生、发展。血脑屏障对脑内的微环境起到严格调控作用。血脑屏障受损后，细胞因子、蛋白等大分子物质进入血管鼻、血管间隙、脑组织中引发功能性损害，可能为脑蛋白病变的发病机制〔7〕。本研究进一步支持了血脑屏障损伤在脑白质病变过程中发挥一定作用。该作用可能为血脑屏障受损时血浆中的大分子物质渗入脑组织，产生神经纤维毒性，引发脑白质病变。

4参考文献

1常馨,霍世会,李晓芸,等.老年脑白质病变患者认知障碍特点及危险因素〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(17):4324-5.

2Jalal FY,Yang Y,Thompson J,etal.Myelin loss associated with neuroinflammation in hypertensive rats〔J〕.Stroke,2012;43(4):1115-22.

3Kim CK,Lee SH,Kim BJ,etal.Age-independent association of pulse pressure with cerebral white matter lesions in asymptomatic elderly individuals〔J〕.J Hypertens,2011;29(2):325-9.

4Fujita Y,Lin JX,Takahashi R,etal.Cilostazol alleviates cerebral small-vessel pathology and white-matter lesions in stroke prone spontaneously hypertensive rats〔J〕.Brain Res,2008;1203(2):170-6.

5杨娴,蓝琳芳,邢世会,等.血脑屏障紧密连接损坏引起大鼠高血压性脑白质病变〔J〕.中国神经精神疾病杂志,2013;39(2):82-7.

6张友平,刘开颜,蔡璇,等.91例缺血性脑白质病变患者的危险因素分析〔J〕.神经损伤与功能重建,2014;9(6):472-4.

7Chida Y,Kokubo Y,Sato S,etal.The alterations of oligodendrocyte,myelin in corpus callosum,and cognitive dysfunction following chronic cerebral ischemia in rats〔J〕.Brain Res,2011;1414(1):22-31.

〔2015-04-19修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

基金项目：国家科学基金资助项目(No.00812736)；河北省自然科学基金资助项目(No.p013206147)；河北省科技攻关计划课题资助项目(No.07278101D-7)

〔中图分类号〕R743.2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6335-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.007