青蒿内生真菌IS928产青蒿素类化合物的发酵培养基优化

周小林， 厉大伟， 周依婷， 邓元元， 兰时乐　(湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128)



青蒿内生真菌IS928产青蒿素类化合物的发酵培养基优化

周小林， 厉大伟， 周依婷， 邓元元， 兰时乐*(湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128)

植物内生菌是指在植物生活史的某一段时期生活在植物组织内部而不引起植物明显病害症状的菌[1]，属于植物组织内的正常菌群，包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌。自短叶红豆杉中分离到产紫杉醇的内生真菌以来[2]，许多研究工作者从长春花[3]、美登木[4]、黄花夹竹桃[5]、薯预[6]、连翘[7]、喜树[8-9]、虎杖[10]、杜仲[11]等植物中分离到能产生与宿主相同或相似的化学成分的内生真菌，表明植物内生真菌能产生功能特殊的次生代谢产物，在农业、医药、工业、食品等领域具有广泛的应用前景[12]。目前，植物内生真菌的研究主要集中在内生真菌的分离、活性成分鉴定等方面，而对植物内生真菌发酵培养基、发酵条件的研究报道较少[13-15]。笔者从健康的青蒿茎秆中分离到一株能产青蒿素类化合物的米曲霉IS928。该菌青蒿素类化合物产量较低，为进一步大规模生产和活性物质的分离、纯化带来困难。笔者研究了包括碳源、氮源、无机盐等对菌株积累青蒿素类化合物的影响，并且采用响应面法对发酵培养基组成进行优化，以期为该菌株规模化生产青蒿素类化合物提供参考依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株。产青蒿素类化合物菌种IS928是从野生青蒿中分离出的内生菌。经形态和分子生物学初步鉴定为米曲霉，被保存于湖南农业大学生物科学技术学院微生物研究室。

1.1.2培养基配方。斜面培养基(PDA)组成为：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂15~20 g，蒸馏水1 000 ml,pH自然;液体种子培养基组成为：葡萄糖2%，豆饼粉1.5%，玉米粉2%，MgSO4·7H2O 0.1%,CaCO30.3%，(NH4)2SO41%，KH2PO40.2%，pH自然；基础发酵培养基组成为：葡萄糖2%，豆饼粉2%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，NaCl 0.05%，pH自然。

1.2方法

1.2.1培养。

1.2.1.1斜面菌种培养。将保存于4 ℃冰箱中的米曲霉IS928接种于新鲜的PDA斜面培养基上，28 ℃培养至成熟，备用。

1.2.1.2液体种子液培养。挑取培养成熟的斜面种子，接种于装有100 ml液体种子培养基的250 ml的三角瓶中，30 ℃，180 r/min恒温振荡培养2 d，备用。

1.2.1.3发酵培养。按10%(V/V)接种量，将培养好的液体种子，接种于装有100 ml发酵养基的250 ml三角瓶中，30 ℃，180 r/min恒温振荡培养5 d,3次重复。

1.2.2发酵培养基配方的筛选。采用单因素试验法，分别改变基础发酵培养基中碳源种类和添加量、氮源种类和添加量、KH2PO4及MgSO4·7H2O添加量，其他条件不变，考察其对青蒿素类化合物产量的影响。

1.2.3发酵培养基的优化。利用Design-Expert8.0.5b软件，在单因素试验结果的基础上，选取对青蒿素类化合物产量影响较大的因素如蔗糖、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O等作为考察对象，以青蒿素类化合物产量为响应值，采用响应面四因素三水平进行试验。因素水平及编码见表1。

1.3测定

1.3.1菌丝体收集。将培养好的发酵液于4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min，倾去上清液后用适量蒸馏水重悬，将菌丝体悬浮液倾倒于20目的筛网上，并且用蒸馏水反复冲洗，直至将培养基残渣洗净，收集菌丝体，于50 ℃下干燥后称重且粉碎。备用。

1.3.2青蒿素类化合物提取。准确称取4.000 g粉碎后的菌丝体，加入100 ml浓度95%的乙醇，超声波处理15 min，抽滤，滤渣重复上述步骤，合并滤液，在真空旋转蒸发仪中50 ℃下浓缩得浸膏，加入适量无水乙醇溶解，倒入50 ml容量瓶中且定容。

表1　设计试验因素水平及编码　%

1.3.3测定。青蒿素类化合物的测定方法参照文献[16]提供的方法进行。取青蒿素类化合物溶液4、16 ml浓度0.2%NaOH，在50 ℃恒温水浴箱中反应30 min，过滤后在292 nm处测定OD值。根据青蒿素标准曲线，计算每100 ml发酵液中青蒿素类化合物的产量。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1碳源种类对青蒿素类化合物产量的影响。改变基础培养基的碳源，分别加入4%的麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、可溶性淀粉、乳糖，其他条件不变，分别测定不同碳源对青蒿素类化合物产量的影响。从图1可以看出，以蔗糖为碳时青蒿素类化合物产量最大，达10.48 mg/L。

2.1.2蔗糖添加量对青蒿素类化合物产量的影响。改变发酵培养基中蔗糖的含量，分别加入2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%的蔗糖，其他条件不变，考察蔗糖不同添加量对青蒿素类化合物产量的影响。从图2可以看出，在一定蔗糖添加量范围内，青蒿素类化合物的产量随蔗糖添加量的增加而增加，当蔗糖添加量为3%时，青蒿素类化合物产量最高。但是，当蔗糖添加量超过3%时，青蒿素类化合物产量明显下降。主要原因为加大蔗糖的添加量，改变基础发酵培养基中的碳氮比，影响菌丝的生长速度和青蒿素类化合物产量的积累。

2.1.3氮源种类对青蒿素类化合物产量的影响。在等氮条件下，改变培养基中氮源种类，分别加入豆饼粉、鱼粉、酵母粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵，其他条件不变，分别考察氮源种类对青蒿素类化合物产量的影响。从图3可以看出，不同的氮源对青蒿素类化合物产量的影响较大。当以酵母粉为氮源时，青蒿素类化合物产量最高。同时，无机氮源不适合该菌积累青蒿素类化合物。

2.1.4酵母粉添加量对青蒿素产量的影响。改变酵母粉的添加量，分别在培养基中加入不同质量百分比的酵母粉(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)，其他条件不变，测定青蒿素类化合物的产量。从图4可以看出，在一定范围内，青蒿素类化合物产量随着酵母粉添加量的增加而增加。当酵母粉添加量为2.5%时，青蒿素类化合物产量最高，但当酵母粉添加量超过2.5%时青蒿素类化合物产量下降。

2.1.5KH2PO4添加量对青蒿素类化合物产量的影响。在发酵培养基中分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的KH2PO4，其他条件不变，分别考察不同KH2PO4添加量对青蒿素类化合物产量的影响。从图5可以看出，青蒿素类化合物产量随KH2PO4添加量的增加而增加，当KH2PO4添加量为0.3%时青蒿素类化合物产量达到15.83 mg/L。

2.1.6MgSO4·7H2O添加量对青蒿素类化合物的影响。分别改变培养基中MgSO4·7H2O的添加量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)，其他条件不变，考察MgSO4·7H2O添加量对青蒿素类化合物产量的影响。从图6可以看出，当MgSO4·7H2O含量为0.2%时，青蒿素类化合物的产量最大。

2.2培养基配方优化

2.2.1青蒿素类化合物产量的方差分析。根据表2试验结果，采用Design-Expert8.0.5b软件对试验结果进行分析。由表3可知，A2、B2、C2、D2对青蒿素类化合物产量的影响极显著(P<0.000 1)，说明蔗糖、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O添加量是青蒿素类化合物合成过程中的重要因素，但只有AB的交互作用较显著(P< 0.05)。该模型极显著，且失拟项不显著，说明数据中无异常点，模型适当。

表2　Box-Benhnken响应面试验结果

表3　响应面结果方差分析

注：*、**分别表示差异在0.05、0.01水平差异。

2.2.2模型的可信度分析。经方差分析，回归方程的复相关系数为0.926 4，说明92.64%的青蒿素类化合物产量变化可由该模型解释；校正相关系数为0.840 6，变异系数为2.88%，信噪比为12.438，说明模型的可信度较高。因此，可采用上述模型代替真实试验点对青蒿素类化合物产量进行分析和预测。

根据响应面系数的回归分析，得到该次模型的拟合方程为：

R=1 744.579 0+17.615 9A-26.394 7B-4.084 7C-19.424 6D-55.935 9AB+39.339 9AC+35.092 1AD+7.911 9BC-17.312 1BD-4.278 2CD-164.342 2A2-168.912 2B2-125.065 2C2-113.075 3D2

对拟合方程自变量求一阶偏导等于0，求解得到青蒿素类化合物产量最大值所对应的优化培养基组成为：蔗糖3.15%、酵母粉2.27%、KH2PO40.254%、MgSO4·7H2O 0.173%，得到预测青蒿素类化合物产量最大值(17.44 mg/L)。

2.2.3响应面分析。采用Design-Expert 8.0.5b软件，对青蒿素类化合物产量的回归模型进行分析。等高线的形状可以反映出各因素之间交互效应的强弱，即圆形表示两因素不显著，而椭圆则表示较为显著[17]。从图7~12可以看出，各响应面图都存在极值，蔗糖和酵母粉添加量、蔗糖和KH2PO4添加量、KH2PO4和MgSO4·7H2O添加量、蔗糖和MgSO4·7H2O添加量对青蒿素类化合物产量存在较显著的交互作用，而酵母粉和MgSO4·7H2O添加量、酵母粉和KH2PO4添加量对青蒿素类化合物产量的交互作用不显著。

2.2.4模型验证。根据响应面优化试验得到各因素的优化值，即在蔗糖3.15%、酵母粉2.27%、KH2PO40.254%、MgSO4·7H2O0.173%条件下进行青蒿内生菌产青蒿素类化合物发酵试验，重复3次，测得青蒿素类化合物平均产量17.19 mg/L。这与理论预测值17.44 mg/L接近，相对误差为1.420 9%，说明该模型能较好地预测青蒿素类化合物的实际产量情况。

3结论与讨论

微生物的代谢产物产量高低除了由菌种自身的遗传性状决定外，还与微生物生长的培养基组成、环境条件密切相关。目前，通过微生物生产活性成分主要有固体发酵法和液体深层发酵法，其中液体深层发酵法具有发酵周期短、易于控制和生物活性成分提取效率高等特点，适于工业化规模生产。利用植物内生真菌发酵生产生物活性物质，曾茜等[18]对蒿属植物内生菌(Penicilliumsp.)产抗癌活性产物的发酵工艺进行了优化；王曦等[19]采用Box-Behnken试验设计和响应面法优化双氢青蒿素生物转化发酵培养基，获得9-羟基双氢青蒿素得率较优化前提高73.30%的理想结果；杨磊等[20]从云南红豆杉树皮中分离到一株产巴卡亭Ⅲ的曲霉属内生真菌，并且对发酵条件进行了初步优化，巴卡亭Ⅲ的产量达34.6 μg/L；高杨[21]采用复合诱变产小檗碱内生真菌获得高产菌株S-NU-3-2，并且优化其发酵条件，小檗碱产量提高了47.2%。笔者从青蒿茎秆中分离到一株能产青蒿素类化合物的米曲霉IS928。在单因素试验基础上，采用响应面法优化该菌株液体深层发酵培养基组成，获得适宜的发酵培养基配方，为蔗糖3.15%、酵母粉2.47%、KH2PO40.291%、MgSO4·7H2O0.193%、NaCl 0.05%，得到青蒿素类化合物产量平均值为17.19 mg/L。

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摘要[目的] 为了开发青蒿素类化合物新的生产方法。[方法] 从青蒿中分离出一株产青蒿素类化合物的内生真菌IS928，采用单因素试验法研究了液态发酵生产青蒿素类化合物合适的培养基，包括碳源、氮源、无机盐等对其产量的影响，并采用响应面法对发酵培养基进行了优化。[结果] 适宜培养基配方为：蔗糖3.15%，酵母粉2.27%，KH2PO40.254%，MgSO4·7H2O0.173%，NaCl0.05%，得到青蒿素类化合物产量平均值为17.19 mg/L。[结论] 该研究为青蒿素类化合物发酵生产的研究提供了理论基础。

关键词内生真菌；青蒿素类化合物；响应面分析法；发酵；优化

Optimization of Fermentational Medium for Endophatic Fungus Producing Artemisinin Derivatives,Artemisiacarvifolia

ZHOU Xiao-lin, LI Da-wei, ZHOU Yi-ting, LAN Shi-le*et al(College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128)

Abstract[Objective] The research aimed to develop the new production method of Artemisinin derivatives.[Method] A endophytic fungus IS928 producing artemisinin derivatives were isolated from Artemisia carvifolia. The effects of optimal medium composition for the production artemisinin derivatives in liquid-state fermentation including carbon sources, nitrogen sources and inorganic salt were studied by using single-factor experiment and the optimal fermentation medium was optimized by using response surface method.[Result] The optimal fermentation medium composition were as follows: sucrose 3.15%, yeast powder 2.27%, MgSO4·7H2O 0.173%, KH2PO40.254%, NaCl 0.05%. Under these conditions, the production of artemisinin derivatives reached 17.19 mg/L.[Conclusion] This study can provide a theoretical basis in fermentation production of Artemisinin derivatives.

Key wordsEndophytic fungus; Artemisinin derivatives; Response surface methodology; Fermantation; Optimization

收稿日期2015-10-12

通讯作者

作者简介周小林(1977-)，男，湖南新化人，硕士研究生，研究方向：天然产物开发。*，副教授，硕士生导师，从事微生物资源与利用方面的研究。

中图分类号S 188+.4

文献标识码A

文章编号0517-6611(2015)32-038-06