利用高通量测序技术筛选地方猪种遗传特质的研究进展与启示

文新望

（湖南省益阳市综合职业中等专业学校，湖南益阳413002）

利用高通量测序技术筛选地方猪种遗传特质的研究进展与启示

文新望

（湖南省益阳市综合职业中等专业学校，湖南益阳413002）

摘要：目前，新一代测序技术已逐渐受到广大科研工作者的关注和认可，广泛应用于动植物的遗传研究和关键基因的筛选中，并在筛选我国地方猪种遗传特质的研究中展现出较强的挖掘能力。本文从当前研究热点转录组和microRNA表达谱出发，综述了利用高通量测序技术筛选地方猪种遗传特质的研究进展，以期为评估地方猪种优良种质特性和挖掘优异基因的工作提供参考。

关键词：高通量测序技术；地方猪种；种质特性；遗传；研究

作者介绍：文新望，女，汉族，湖南益阳人，中教一级职称，主要从事生物和计算机的教学工作

据统计，我国现有88个地方猪种，是猪种资源最丰富的国家之一。地方猪种根据体型外貌、生产性能、气候条件等可大致分为华北、华中、华南、西南、江南和高原六个类型［1］，它们所具有的耐粗饲、抗逆性强、肌内脂肪含量高以及繁殖力强等优良种质特性，不仅受到国人的广泛关注，还对世界猪种改良做出了较大贡献；同时，它们也是研究猪的特定遗传性状的最佳素材。但在外来猪种生长速度较快、瘦肉率较高的优点冲击下，地方猪种的饲养受到很大影响，其饲养范围逐步缩小。近年来，地方猪种资源的保护和利用越来越受到政府和社会各界的关注，在健全法律法规、推进开发利用以及建设地方猪保种场等方面的工作取得了突出成效，如颁布实施了《中华人民共和国畜牧法》，建设保种场，划定保护区，建立基因库和培育配套系等［2］。与此同时，在科学技术不断发展进步的情况下，对地方猪种深入开展系统研究，利用分子生物学技术评估优良种质特性和挖掘优异基因也是刻不容缓的一项工作。近年来，新一代测序技术因测序通量高、速度快及测序成本低等优点，逐渐受到广大科研工作者的关注和认可，广泛应用于动植物的遗传研究和关键基因的筛选中，并在筛选我国地方猪种遗传特质的研究中展现出较强的挖掘能力。本文从当前研究热点转录组和microRNA（miRNA）表达谱出发，综述了利用高通量测序技术筛选地方猪种遗传特质的研究进展，以期为评估地方猪种优良种质特性和挖掘优异基因的工作提供参考。

1 高通量测序技术简介

当前的高通量测序技术是指在双脱氧核苷酸末端终止法（Sanger法）的基础上发展起来的具有测序通量高、速度快、成本低等优点的第二代测序技术［3］。目前得以广泛应用的测序技术有三种，即罗氏公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLID技术，三者的原理、数据量产出、数据质量和运行成本均有不同，但其测序步骤大致相当，依次为模板准备、测序和成像、序列组装和比对等［4］。由于目前测序技术多由各生物信息技术公司提供，本文仅对这三种测序技术做如下简要介绍。454测序技术是一种依靠生物发光进行cDNA序列分析的技术，在一系列酶的协同作用下使得引物的每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光信号获得DNA序列，其主要优点为读段较长，可达600～1 000 bp，但其通量最低［5，6］。Solexa技术的主要原理是边合成边测序，利用单分子阵列在小型芯片上进行桥式PCR反应，在采用新的可逆阻断技术后，合理实现每次只合成一个碱基，其主要优点是测序通量大，结果较为精确，但读段通常仅为100～200 bp［5，6］。SOLID技术主要采用双碱基编码原理，通过寡核苷酸连接和检测进行测序，尽管其读段仅为50 bp左右，但测序错误率大大降低［5，6］。

2 地方猪种的转录组研究

转录组是生物体特定组织或细胞在某一特定时间（包括发育状态或功能状态）转录出来的所有RNA集合。高通量测序技术可将这一RNA集合测序出来以从整体水平研究基因功能，从差异样品中筛选出差异表达的基因，结合生物信息学技术分析得到调控不同表型的关键基因，从而揭示导致不同表型的分子机理。

骨骼肌是动物体内最多的组织，约占体重的40%，其在骨和关节的配合下，通过收缩和舒张，完成各种躯体活动，对其进行发育和种间比较转录组研究以揭示分子机理尤为重要。Zhao等［7］采用Solexa测序技术对蓝塘猪和长白猪35、49、63、77和91胚龄以及2、28、90、120和180日龄的骨骼肌进行了发育和比较转录组研究，在蓝塘猪肌肉生成早于长白猪却慢于长白猪的情况下，共计鉴定出595个差异表达的基因，其中：GSK3B、IKBKB、ACVR1、ITGA和STMN1对后期肌肉的形成具有促进作用，ID1、ID2、CABIN1、MSTN、SMAD4、CTNNA1、NOTCH2、GPC3和HMOX1高表达于蓝塘猪的骨骼肌而致使其分化速度减慢。Zhao等［8］采用Illumina Hi-Seq2000对通城猪和大白猪30、40、55、63、70、90和105胚龄及0、7、21和35日龄的骨骼肌进行了转录组研究，在通城猪各发育阶段骨骼肌中共鉴定出4 331个差异表达基因，而大白猪中仅有2 259个，表明通城猪的骨骼肌发育受到的调控更为复杂；此外，发现CXCL10、EIF2B5、PSMA6和FBXO32在通城猪骨骼肌发育过程中具有重要的调控作用。Xu等［9］对梅山猪65胚龄及3、60和120日龄的骨骼肌进行了转录组研究，共计鉴定出338个差异表达的基因，蛋白质谱分析发现66个差异表达的基因，功能分析显示其功能主要集中于代谢、肌原纤维细丝形成、细胞骨架形成、收缩活动和信号转导。陈伟［10］比较了280日龄莱芜猪和大白猪骨骼肌的转录组，共计鉴定出10 482个基因表达于二者的骨骼肌中，其中739个基因仅表达于莱芜猪，差异表达分析发现，98个基因在莱芜猪中的表达上调，80个下调。赵栓平［11］比较研究了长白猪、通城猪和五指山猪33、65和90胚龄骨骼肌的转录组，结果发现长白猪、通城猪和五指山猪中分别有1 402、912和1 910个差异表达基因；三个品种猪中有190个共同的差异表达基因，长白猪和通城猪中有233个共同的差异表达基因，长白猪和五指山猪中有230个共同的差异表达基因，通城猪和五指山猪中有83个共同的差异表达基因。

地方猪种的肌内脂肪含量远远高于外来猪种，对二者进行转录组研究不仅有利于筛选出调节肌内脂肪含量的关键基因，还能深入了解地方猪种高肌内脂肪含量的分子机理。Yu等［12］研究发现蓝塘猪背最长肌L*值、肌内脂肪含量显著高于长白猪，pH45分钟值、pH24小时值和剪切力值低于长白猪，转录组研究共鉴定出586个差异表达的基因，其中267个高表达于蓝塘猪，并鉴定出SCD基因可显著提高多不饱和脂肪酸比率而降低饱和脂肪酸比率。Wu等［13］比较研究了30、90和150日龄的金华猪和长白猪背最长肌的转录组，共计鉴定出2 001个差异表达的基因，分析发现调节脂肪酸生成相关基因高表达于金华猪，其中在90日龄的金华猪背最长肌中高表达的pFLJ基因与脂肪沉积相关。此外，脂肪沉积相关基因的筛选也有助于深入了解地方猪种肌内脂肪含量高的分子机理。Xing等［14］比较研究了不同背膘厚度的松辽黑猪的皮下脂肪转录组，共计鉴定出188个差异表达的基因，主要富集于脂肪酸合成代谢、脂质合成和脂肪酸代谢过程。Li等［15］比较了脂肪型地方猪和瘦肉型外来猪皮下脂肪组织的转录组，结果表明1 596个基因差异表达，其中84个仅表达于地方猪。

此外，包括垂体和乳腺在内的一些地方猪种的腺体发育转录组也有相关报道。Shan等［16］对45、120和180日龄的巴马香猪和45、120和240日龄的藏猪垂体组织进行了转录组研究，分别有1 382和1 162个基因仅表达于巴马香猪和藏猪垂体组织，巴马香猪中按日龄依次有1 123、64和172个基因高表达，而藏猪依次有1 379、210和132个基因高表达，4个激素基因（GH、PRL、LHB和FSHB）在两个猪种的各发育时间段均高表达。Zhao等［17］研究了妊娠80、100和110天的母猪乳腺转录组，比较鉴定出1 409个差异表达的基因，富集于脂肪酸合成代谢、mTOR信号通路等，其中TP53、ARNT2、E2F4和PPARG对妊娠期乳腺的后期发育具有重要的调控作用。

3 地方猪miRNA表达谱研究

microRNA（miRNA）是一系列长约22 nt的非编码RNA，它们通过靶向mRNA的3’非翻译区在转录水平调节基因的表达，研究表明细胞过程中的信号转导、细胞循环、分化和形态转化中表达的基因，其中大于60%的基因受miRNA直接调节［18］。

在肌肉组织中，Hou等［19］等量混合通城猪18个发育时间点的背最长肌总RNA后，采用Solexa技术鉴定出275个已知的miRNA，新预测出78个miRNA。Zhao等［20］从通城猪33、65、90胚龄和180日龄的骨骼肌中共计鉴定出779个miRNA，差异表达的miRNA达214个。Zhou［21］以90胚龄和120日龄大白猪和二花脸猪杂交后代的骨骼肌中共计鉴定出47个miRNA，其中29个差异表达。

在脂肪组织的研究中，通过比较不同发育阶段以及不同品种的miRNA表达谱，鉴定出大量新的miRNA。Li等［22］采用Solexa技术对7和240日龄的荣昌猪背部皮下脂肪组织进行了miRNA表达谱研究，鉴定出227个miRNA，新预测出59个，其中有126个miRNA差异表达。Chen等［23］比较研究了150日龄大白猪和梅山猪背部皮下脂肪组织miRNA表达谱，鉴定出215个差异miRNA，新预测出140个，其中142个差异表达。Li等［24］通过比较蓝塘猪和长白猪脂肪组织鉴定出171个miRNA，差异表达的miRNA达48个。

在生殖器官或组织中，Li等［25］采用Solexa技术比较了210日龄藏猪睾丸组织和卵巢组织miRNA表达谱，鉴定出732个miRNA，其中336个共表达于两个组织，分别有115和222个miRNA仅表达于卵巢和睾丸组织，且24个位于X染色体上miRNA在卵巢中的表达量显著高于睾丸组织。Liu等［26］比较研究20和210日龄藏猪睾丸组织的miRNA表达谱，鉴定出461个miRNA，新预测出121个miRNA，差异表达的miRNA数量达303个。Lian等［27］采用Solexa技术对30和180日龄军牧-1猪睾丸组织miRNA表达谱进行了研究，共鉴定出469个miRNA，新预测56个，且有15个miRNA为猪特有，差异表达的数量达122个。

4 筛选地方猪种遗传特质的方向与启示

综上所述，近年来随着分子遗传学的迅速发展，地方猪种的种质特性不断被挖掘。高通量测序技术出现后，使得从整体水平全面解析地方猪种的这些种质特性成为可能，这不仅有利于评估优良种质特性和挖掘优异基因，还能为深入研究基因功能提供理论依据。但是，仅从转录组学和miRNA表达谱进行研究，相比于复杂的生理过程，其结果显得较为单一，且现有数据仍可挖掘出很多有价值的信息，因此，在利用高通量技术挖掘种质特性的遗传信息时，可以引入蛋白组学和GWAS（全基因组关联分析）进行多组学研究，达到相互印证的效果，采用多种生物信息学方法深入挖掘现有数据以获得更多有价值的遗传信息；此外，对已挖掘出的优异基因进行深入的功能研究也是很有必要的；高通量测序技术这种从整体水平到单个基因功能的研究模式，为其进一步应用于猪遗传改良、指导辅助育种工作、提高选择的效率和准确度提供了理论依据。

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中图分类号：S813.9

文献标识码：B

文章编号：1673-4645（2016）05-0067-04

收稿日期：2016-03-31