非结核分枝杆菌MmpL家族同源性分析及拓扑结构预测

孙　妍，陈高瞻，占卫红，雷　航，王心倩，余晓丽

(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)



非结核分枝杆菌MmpL家族同源性分析及拓扑结构预测

孙妍，陈高瞻，占卫红，雷航，王心倩，余晓丽

(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)

摘要：以非结核分枝杆菌中的胞分枝杆菌、鸟分枝杆菌和耻垢分枝杆菌三个标准株为研究对象，对其MmpL家族蛋白的同源序列进行相似性分析和功能预测。根据NCBI数据库中分枝杆菌MmpL蛋白序列进行多重序列比对；用TMHMM Server 2.0在线软件对MmpL同源序列进行拓扑结构预测；用Interproscan对MmpL3同源序列进行保守序列和结构域分析。同源分析结果显示：与H37Rv MmpL家族比较，胞分枝杆菌中没有发现MmpL2、MmpL6、MmpL7、MmpL8、MmpL9、MmpL12和MmpL13的同源序列；鸟分枝杆菌没有发现MmpL6、MmpL7、MmpL8、MmpL9、MmpL12和MmpL13的同源序列；耻垢分枝杆菌没有发现MmpL2、MmpL7、MmpL9、MmpL10、MmpL12和MmpL13的同源序列，推测可能与菌种差异性有关；拓扑结构预测发现大部分同源序列跨膜次数与H37Rv的对应MmpL蛋白保持一致，少数序列与H37Rv的对应MmpL蛋白有较小偏差；保守序列分析发现：与H37Rv比较三个标准株的MmpL3同源序列有两个膜转运蛋白结构域(MMPL domain)，没有固醇敏感多肽区(SSD domain)说明该同源序列有膜转运功能，无SSD介导的胆固醇自我平衡调节、物质运输以及细胞信号转导等功能。研究结果为进一步阐明非结核分枝杆菌的毒力、致病机制和疾病趋势提供基础资料。

关键词：非结核分枝杆菌；MmpL家族蛋白；同源序列；拓扑结构

1引言

非结核分枝杆菌(NontuberculosisMycobacteria，NTM)是指结核分枝杆菌复合群(M.tuberculosscomplex)、麻风分枝杆菌(M.leprae)以外的分枝杆菌。其中部分是致病菌或条件致病菌，临床上能引起人类疾病的主要有堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌等10余种[1]。广泛存在于环境中，能引起人类和动物肺部病变和肺部外其他部位患病[2]，做为条件致病菌可与结核分枝杆菌混合感染。临床症状多与结核分枝杆菌相似，在临床诊断上容易误诊，通过抗酸染色不能分辨[3]。且对多种抗结核药物具有耐药性。

MmpL家族是分枝杆菌耐受-结节-分裂家族(resistance-nodulation-cell division family,RND家族)超家族蛋白中特有的一类膜蛋白，是影响分枝杆菌的生存和毒力的关键因子之一[3]，主要参与细胞内的物质运输和药物外排[4-6]。RND家族中固醇敏感多肽区(SSD domain)在胆固醇自我平衡调节、物质运输以及细胞信号转导中发挥重要的作用[7]。此外，研究发现，在基因组中，有大约20%—30%的基因产物被预测为膜蛋白，在药物研发过程中，膜蛋白偶联受体是绝大多数药物的作用靶点，跨膜蛋白在生物体中担负着各种各样的重要功能：细胞的运输，细胞膜内外信号的传递及能量转换等[8]。由于膜蛋白数量巨大而且功能多样，因此通过跨膜蛋白的拓扑结构能对其功能进行初步预测。

笔者以非结核分枝杆菌胞分枝杆菌、鸟分枝杆菌和耻垢分枝杆菌标准株为研究对象，对其MmpL家族蛋白进行同源性分析、跨膜结构预测以及保守序列和结构域预测，为进一步阐明抗酸染色阳性非结核分枝杆菌的毒力、致病机制和疾病研究提供理论依据。

2方法和步骤

2.1方法

运用生物信息学方法，通过序列对比，跨膜结构预测，保守序列和结构分析等生物信息学手段，对胞分枝杆菌(M.intracellulareATCC13950)、鸟分枝杆菌(M.aviumsubsp.paratuberculosisK-10)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatistrMC2155)的MmpL家族蛋白进行同源序列分析及功能预测。

2.2步骤

2.2.1MmpL家族蛋白同源序列比对

在NCBI数据库中查找结核分枝杆菌(MTB)H37Rv的MmpL家族蛋白的氨基酸序列，在BLAST搜索三个标准株的同源序列。

2.2.2MmpL家族蛋白跨膜结构预测

用TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软件对MmpL家族蛋白进行拓扑结构预测。

2.2.3MmpL3保守序列分析

用Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)对MmpL3进行保守序列和结构域分析。

3结果

3.1MmpL家族蛋白同源序列比对

同源分析结果显示：与H37Rv的MmpL家族蛋白比较，胞分枝杆菌同源序列为MmpL1(Ident，63%)，MmpL3 (Ident， 68%)，MmpL4(Ident，62%、57%、54%)，MmpL5(Ident，73%)，MmpL10(Ident，61%)，MmpL11(Ident，72%)；鸟分枝杆菌同源序列为MmpL1(Ident，53%)，MmpL2(Ident，61%)，MmpL3(Ident，70%)，MmpL4(Ident，66%、62%、61%、60%、58%)，MmpL5(Ident，73%)，MmpL10(Ident，57%)，MmpL11(Ident，76%)；耻垢分枝杆菌同源序列为MmpL1(Ident，54%、46%)，MmpL3(Ident，67%)，MmpL4(Ident，66%、63%、56%、55%)，MmpL5(Ident，69%、64%)，MmpL6(Ident，51%)，MmpL8(Ident，56%、51%)，MmpL11(Ident，69%)。此外，同源比对还发现在胞分枝杆菌中没有发现MmpL2、MmpL6、MmpL7、MmpL8、MmpL9、MmpL12和MmpL13的同源序列；鸟分枝杆菌没有发现MmpL6、MmpL7、MmpL8、MmpL9、MmpL12和MmpL13的同源序列；耻垢分枝杆菌没有发现MmpL2、MmpL7、MmpL9、MmpL10、MmpL12和MmpL13的同源序列。

3.2MmpL家族蛋白跨膜结构预测

用TMHMM 2.0软件对MmpL家族蛋白及其同源序列跨膜结构预测见表1，胞分枝杆菌，鸟分枝杆菌，耻垢分枝杆菌的MmpL3同源蛋白跨膜次数分别为10、10、11(图1)。

图1　MmpL3跨膜结构预测(A—D)

对三个标准株MmpL家族蛋白序列进行同源比对和拓扑结构预测，结合同源性、蛋白注释和跨膜次数筛选出MmpL家族成员见表1。

表1MmpL家族成员

成员H37RvM.intracellulareATCC13950M.aviumsubsp.paratuberculosisK-10M.smegmatistr.MC2155成员TMMs成员TMMs成员TMMs成员TMMsMmpL1Rv0402c12OCU0075011MAP007612MSMEG038112MSMEG018012MmpL2Rv050711NOMAP3049c12NOMmpL3Rv0206c11OCU4887010MAP3641c12MSMEG025011MmpL4Rv0450c11OCU4565011MAP375111MSMEG349611OCU3155011MAP389011MSMEG022511MSMEG046311MmpL5Rv0676c12OCU2492011MAP173812MSMEG438312MSMEG138212MmpL6Rv15575NONONOMmpL7Rv294212OCU5116012NONOMmpL8Rv3823c12NONOMSMEG474112MSMEG462512MmpL9Rv233911NONONOMmpL10Rv118311OCU1835011MAP22326NOMmpL11Rv0202c12OCU4892012MAP3637c12MSMEG024111MmpL12Rv1522c11NONONOMmpL13a)Rv11454NONONOb)Rv11466NONONOMmpLNNO748Total14151219

注：TMMs：跨膜次数；MmpL N：表中所列之外的MmpL家族蛋白成员。

3.3MmpL3同源序列结构域预测

H37Rv的MmpL3结构域预测显示具有两个膜转运蛋白(MMPL domain)结构域和一个固醇敏感多肽区(Sterol-sensing domain, SSD)，三个标准株的MmpL3同源蛋白均有两个膜转运蛋白结构域，没有SSD结构域，说明该同源序列有膜转运功能，无SSD结构域介导的胆固醇自我平衡调节、物质运输以及细胞信号转导功能(图2)。

图2　MmpL3跨膜结构(A-D)

4讨论

MmpL家族蛋白是一组与结核分枝杆菌药物外排有关的一个跨膜蛋白家族，可作为抗结核药物或菌种鉴定药物提供靶位点。通过对三个标准株的生物信息学分析得到MmpL家族同源序列，其中胞分枝杆菌为15个，鸟分枝杆菌为12个，耻垢分枝杆菌为19个。经过同源分析和跨膜预测综合分析最终胞分枝杆菌确定7个同源序列，鸟分枝杆菌确定10个同源序列，耻垢分枝杆菌确定11个同源序列。与2005年研究结果[8]相比得到更为精确的结果，该文献只对鸟分枝杆菌中的8个同源蛋白进行了同源分析，这8个序列中有5个序列与本实验分析结果相同，3个序列分析结果不同，有10个成员分析不够精确。在分析MmpL家族成员的同源蛋白的过程中增加跨膜结构作为分析条件未见报道。

除此之外在对实验所得同源序列进行比较分析的过程中发现三个标准株中大多数MmpL蛋白存在同源序列，但是胞分枝杆菌没有MmpL2、MmpL6、MmpL8、MmpL9蛋白的同源序列；鸟分枝杆菌没有MmpL6、MmpL7、MmpL8、MmpL9、MmpL12和MmpL13同源序列；耻垢分枝杆菌没有MmpL2、MmpL6、MmpL7、MmpL10、MmpL12和MmpL13同源序列；这种现象可能与菌种差异性有关，可能为以后菌种鉴定提供理论支持。

对MmpL3进行保守序列和结构域分析发现MmpL3的同源序列有膜转运功能蛋但可能不具有SSD结构域在胆固醇自我平衡调节、物质运输以及细胞信号转导中的作用，这可能与菌种遗传差异有关，可能为后续菌种鉴定提供依据。

参考文献：

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[10]Pilar Domenech, Michael B Reed,Clifton E Barry. Contribution of the Mycobacterium tuberculosis MmpL Protein Family to Virulence and Drug Resistance[J]．Infection and Immunity．2005，73(6)：92-101．

Homology analysis and function prediction of MmpL

protein family ofNontuberculousMycobacterion

SUNYan,CHENGao-zhan,ZHANWei-hong,LEIHang,WANGXin-qian,YUXiao-li

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：To provide evidence for future research on the structures and function of MmpL protein family in Mycobacterium ,this study analyzed homologous sequences, predicted topological structures and predicted conservative domain structures of three Nontuberculous Mycobacterion named M. intracellulare, M. avium subsp.paratuberculosis K-10 and M. smegmatisstr. According to the homologous sequences three of NTM all have theregion of deletions. For example the M. intracellulare haven’t MmpL2, 6, 7, 8, 9, 12, 13，M. avium subsp.paratuberculosis K-10haven,t MmpL6, 7, 8, 9, 12, 13，M. smegmatisstrhaven,t MmpL2, 7, 9, 10, 12, 13. According to the topological structures many of the homologous sequences have the same transmembrane and few of them have different transmembrane, but all of them have little difference. Conservative sequence analysis found that: compared with H37Rv three standard strains of MmpL3 homologous sequences, there were two membrane transport protein structure domain (MMPL domain), no sterol-sensing domain(SSD domain) showd the membrane function, the homologous sequence of no self balance function of intracellular cholesterol levels.The research results further clarify the virulence of M. tuberculosis, pathogenic mechanism and trend of disease to provide basic data.

Key words：Nontuberculous Mycobacterion；MmpL protein family；homologous sequence；topological structure

中图分类号：Q 93

文献标识码：A