脊髓继发性损伤后细胞因子的表达及其对细胞凋亡的作用

王诗军 李钰婷 李淳德



脊髓继发性损伤后细胞因子的表达及其对细胞凋亡的作用

王诗军 李钰婷 李淳德

【关键词】脊髓损伤；脊髓损伤，继发性；细胞凋亡；细胞因子类；神经元；白细胞介素类

脊髓损伤是骨科损伤中非常常见的中枢神经系统损伤，且发生率高、致残率高。脊髓损伤可分为原发性脊髓损伤与继发性脊髓损伤。脊髓继发性损伤是在原发性损伤的基础上，在细胞分子水平上主动调节的过程，是组织发生变性坏死的过程。脊髓继发性损伤包括了局部缺血缺氧、免疫炎性反应、自由基损伤及脂质过氧化等一系列病理过程，而免疫炎性反应是继发性损伤中最为重要的病理过程之一[1]。继发损伤引起细胞死亡的方式主要为细胞凋亡。正常生理条件下，细胞凋亡是维持组织系统稳定的一种主动方式，当发生损伤时，细胞凋亡往往受细胞内外环境影响而严重紊乱，导致凋亡细胞比例增多而对机体产生继发损伤。脊髓损伤后大量的神经元发生凋亡坏死，直接导致了运动及感觉功能的丧失。脊髓损伤后 6 h 至 3 周会发生细胞凋亡，尤其是在脊髓白质，凋亡细胞呈阳性少突胶质细胞标记[2]。细胞凋亡是脊髓损伤后脊髓神经元死亡的一种重要方式，在继发性损伤中起极为重要的作用，神经元凋亡是脊髓损伤后二次损伤的关键因素[3-4]。在脊髓损伤中，凋亡细胞可于受伤脊髓部位甚至周边节段被检测出来，凋亡发生于几乎脊髓所有种类的细胞中。细胞凋亡的调控是十分复杂的，损伤后脊髓局部多种细胞因子的表达和炎症反应是导致脊髓内各种细胞凋亡的始动因素[5]。

细胞因子在中枢神经系统中具有广泛的生物活性，炎性细胞因子在脊髓损伤后表达迅速升高，说明炎症反应是脊髓损伤后早期发生的重要事件之一[6]。细胞因子包括白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α 和化学趋化因子等多达数十种的庞大家族。在脊髓损伤后肿瘤坏死因子表达明显增加，引发其它细胞因子瀑布式的分泌而导致强烈的炎症反应，在脊髓损伤后第二次打击中起着关键性的作用。脊髓损伤后肿瘤坏死因子-α 及白细胞介素家族相继释放增加并持续至再灌注后 24 h 仍维持较高水平[7]，各因子的血浆变化滞后于脊髓组织变化，细胞因子参与了早期脊髓损伤的发生过程。中枢神经系统损伤后轴突不能再生的主要原因是抑制性微环境的产生，白细胞介素-1 在脊髓损伤后局部微环境改变有重要影响，其它如白细胞介素-6 和白细胞介素-8 等细胞因子在脊髓损伤后的继发性缺血水肿反应中亦起着同等重要的作用。研究炎性细胞因子在脊髓损伤和对细胞凋亡过程中所起的作用，将有助于阐述中枢神经系统疾病的发生机制和有利于找到针对性的治疗手段。现就细胞因子对脊髓损伤后细胞凋亡的作用综述如下[8-9]。

一、白细胞介素与脊髓继发性损伤后细胞凋亡

白细胞介素是能够介导白细胞之间和白细胞与其它细胞之间相互作用的细胞因子。白细胞介素-1、-2、-6、-8、-12、-15 和 -18 是其中的炎性因子，而白细胞介素-4、-10 和 -13 是其中的抗炎性因子，白细胞介素中的促炎因子、抗炎因子和调节因子在脊髓损伤中起重要的作用。

白细胞介素-1β（IL-1β）是脊髓损伤后启动神经元和少突胶质细胞凋亡的胞外信号。脊髓损伤后，脊髓组织内神经胶质细胞和神经细胞均能表达大量的细胞因子白细胞介素-1、白细胞介素-6，参与机体炎症反应[10]。同样研究发现白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α 存在于正常的脊髓组织内，脊髓损伤后白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α 表达迅速增强，提示白细胞介素-1β 和肿瘤坏死因子-α 协同参与了继发性脊髓损伤过程，并可能是引发凋亡的主要因素[11]。脊髓损伤后白细胞介素-1β mRNA 瞬时表达增加，白细胞介素-1β 蛋白水平增加，脊髓损伤后 72 h 有细胞凋亡发生，caspase-3 活性增加，应用白介素-1 受体拮抗剂可以抑制细胞凋亡和 caspase-3 活性。也有研究通过建立 SD 大鼠急性脊髓损伤模型，经白细胞介素-1 受体拮抗剂治疗后，损伤脊髓组织白细胞介素-1β 和核因子 κB 的表达均显著降低[12]。说明白细胞介素-1 受体拮抗剂可通过抑制白细胞介素-1β 和核因子 κB 的表达，减轻局部炎症反应，对急性脊髓损伤大鼠损伤段脊髓发挥保护作用。

李春阳等[13]的研究结果显示：炎症因子白细胞介素-1β 与肿瘤坏死因子-α 的生成与释放在 6～48 h 时增多，细胞凋亡作为缺血损伤后神经元损失的主要形式之一，在 24～48 h 时最为严重，脊髓损伤后的白细胞介素-1β，P38 蛋白水平增加，伤后 6 h 表达达到峰值，损伤后 24 h caspase-3 的表达增加；损伤后 6 h 检测到了 TUNEL 阳性细胞，损伤后 24 h TUNEL 阳性细胞增加；鞘内注射白细胞介素-1 受体拮抗剂显著降低 P38 蛋白和 caspase-3 的表达，并减少了 TUNEL 阳性细胞的数目。此外，鞘内注射P38 蛋白的抑制剂 SB203580 也可显著减少的 caspase-3 的表达，并减少脊髓损伤后 TUNEL 阳性细胞数[8]。

白细胞介素-6 是趋化因子的一种细胞因子，由多种细胞产生，同时也作用于多种细胞，研究表明白细胞介素-6 具有广泛生物学功能，白细胞介素-6 能够参与细胞增殖和凋亡过程、作为运动应激中产生的细胞因子，对机体的代谢、炎症和疾病都产生一定的影响。临床研究中对脊髓损伤患者在治疗前后测定白细胞介素-6 的含量，观察其治疗前后的变化，对判断脊髓损伤预后具有重要的价值[14-15]。研究证实脊髓损伤者入院第 2 天血清中白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α 含量水平较健康人显著升高[16]。脊髓损伤后 1 h 白细胞介素-1α mRNA 表达达到高峰，白细胞介素-1β 和白细胞介素-6 mRNA 在 6 h 达到高峰，白细胞介素-6 血浆浓度增加在脊髓损伤细胞凋亡中起重要作用[17]。

脊髓损伤后大鼠体内肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-8的表达上升[18]，白细胞介素-8 可强烈地趋化诱导中性粒细胞在组织中的浸润，其在炎症反应引起的继发性损伤中发挥重要作用。大剂量甲泼尼龙早期应用可抑制白细胞介素-8 和肿瘤坏死因子-α 的分泌，减轻脊髓损伤局部炎症反应的程度[19]。甲泼尼龙通过抑制上述两种细胞因子干预急性脊髓损伤，但是甲泼尼龙干预的作用是有限的，使用应越早越好，综合使用包括甲泼尼龙等药物治疗在内的多种手段干预是十分必要。

白细胞介素-10 对脊髓损伤后炎症介质核转录因子-κB 表达和局部单核/巨噬细胞浸润有抑制作用，两种机制共同作用有效抑制了脊髓损伤早期炎症的发生[20]。有研究建立大鼠脊髓损伤模型，用免疫组织化学方法观察白细胞介素-10 及甲泼尼龙对大鼠脊髓损伤后 120 h 内脊髓内皮细胞表面表达的细胞间黏附分子-1 的表达变化，结果显示细胞表面表达的细胞间黏附分子-1 参与了继发性脊髓损伤早期的病理过程，继发性脊髓损伤后早期应用白细胞介素-10 及甲泼尼龙阻断细胞间黏附分子-1 的表达有助于减轻继发性脊髓损伤的损害程度[21]。白细胞介素-10 选择性抑制单核-巨噬细胞源性泡沫细胞形成中趋化因子mRNA 的表达与有效地抑制核因子 κB 活性密切相关。这对降低炎症反应，减少细胞凋亡，延缓动脉粥样斑块形成具有重要意义[22]。

同样研究发现褪黑素可以通过提高白细胞介素-10 的表达及抑制白细胞介素-6 和白细胞介素-8 的表达，来改善损伤后神经的脂质过氧化反应和炎症反应来修复损伤神经[23]。这可能是改变脊髓损伤区的微环境，减少脊髓继发性损伤，促进损伤脊髓功能恢复的机制之一。白细胞介素-10/白细胞介素-10 受体系统为靶位可能成为一个新的治疗方向[24]。

二、肿瘤坏死因子-α 与脊髓继发性损伤后细胞凋亡

促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在许多损伤诱导过程中起重要作用[25]。肿瘤坏死因子-α 为 157 个氨基酸组成的细胞因子，在克隆的全长 cDNA 的 5 端有480bP 的非编码区包括 76 个氨基酸信号肽编码区。肿瘤坏死因子诱导细胞凋亡的机制是由多种分别具有正调和负调作用的配体/受体间相互作用所介导的，肿瘤坏死因子作为炎性细胞因子标志之一，在脊髓损伤后神经细胞凋亡起重要作用[26]。

于腾波等[27]收集急性脊髓损伤的尸检脊髓组织标本，发现脊髓损伤后 6 h 标本中可见活化的小胶质细胞，其数量的高峰出现在损伤后 24 h，部分小胶质细胞为肿瘤坏死因子-α 阳性细胞。说明活化的小胶质细胞可能参与了脊髓的损伤过程，小胶质细胞合成和分泌的肿瘤坏死因子-α 是脊髓损伤组织内肿瘤坏死因子-α 的主要来源之一。脊髓损伤后 4 h 在损伤周围病灶可见 TUNEL 阳性细胞，脊髓损伤后 24～48 h 阳性细胞数最多，损伤周围区域神经元和神经胶质细胞中有肿瘤坏死因子-α 表达，脊髓损伤后 4 h，一氧化氮水平增加，从而促进了细胞凋亡[28]。

在脊髓损伤急性期用脊髓损伤肿瘤坏死因子-α 拮抗剂（依那西普）治疗后能显著抑制肿瘤坏死因子-α 的表达，脊髓损伤后 2 周有髓鞘形成，治疗后 12 h 至 1 周脊髓白质和灰质区 TUNEL 阳性神经元、少突胶质细胞显著减少，抑制脊髓损伤后 caspase-3 和 caspase-8 过表达。脊髓损伤肿瘤坏死因子-α 拮抗剂可以减少脊髓损伤后组织损伤，改善运动功能，并促进髓鞘再生，对肿瘤坏死因子-α 和 caspase-3、caspase-8 过表达的抑制，减少了神经元和少突胶质细胞凋亡[29]。在损伤区域注射肿瘤坏死因子-α中和抗体后诱导型一氧化氮合酶表达和一氧化氮水平减少，TUNEL 阳性细胞数量减少，肿瘤坏死因子中和抗体不仅可抑制脊髓损伤后细胞凋亡，改善脊髓功能障碍，也可抑制离体脊髓神经元凋亡[30-31]。

肿瘤坏死因子 TNF 受体超家族及其各自的配体在脊髓损伤后表达上调，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 TRAIL及其受体 DR5 在损伤周围病灶白质和灰质中有表达，TRAIL 免疫性中性白细胞减少可以改善功能恢复，减少细胞凋亡数量，调节炎症因子 FasL、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β 的表达，并调节 caspase-8、caspase-3 活性及 Bax 和 Bcl-2 表达。糖皮质激素诱导的 TNF 受体超家族相关蛋白（GITR）配体（GITRL）在脊髓损伤后表达上调，GITR 基因敲除后 TRAIL 及其受体 DR5 表达减少，TRAIL 和 GITRL 促进了脊髓损伤相关炎症反应损伤，TNF 受体超家族及其各自的配体将成为脊髓损伤的新疗法[32]。

研究证实早期芒针治疗可显著抑制脊髓损伤炎性因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β 的表达，改善局部微环境，促进损伤后期大鼠运动功能的恢复[33]。同样动物实验结果显示[34]脊髓损伤后 4 h 时，亚低温组大鼠白细胞介素-1β 和肿瘤坏死因子-α mRNA 的表达明显受到抑制，亚低温可明显抑制脊髓损伤后的炎症反应。抑制肿瘤坏死因子-α 的表达可能会成为治疗脊髓损伤的一个有用手段。

三、其它细胞因子与脊髓继发性损伤后细胞凋亡

Fas/FasL 信号通路在细胞凋亡、各种神经疾病的炎症反应神经胶质增生中起重要作用，在急性和亚急性脊髓损伤情况下 Fas 介导神经元和少突胶质细胞凋亡发生[35]。Fas 受体激活与脊髓损伤后细胞凋亡有关，Fas 配体与抗体的中和可以促进脊髓损伤后轴突再生和功能恢复，抑制 Fas 介导的 caspase-3 活化，Fas 基因缺失后损伤区 TUNEL 阳性细胞数量、凋亡相关因子、活化的caspase-9 和 caspase-3 表达减少，抗凋亡蛋白 Bcl-2 和Bcl-xL 的表达增加。因此 Fas 缺失可以减少脊髓损伤后细胞凋亡，促进运动功能恢复。抑制 Fas 受体对急性脊髓损伤有神经保护作用[36-38]。

脊髓损伤后促炎细胞因子巨噬细胞游走抑制因子（MIF）升高，巨噬细胞的表型分为促炎（M1）或抗炎（M2）两种。M1 与促炎介质白细胞介素 12p70 和干扰素 γ 诱导的蛋白 10 kDa 的高水平表达相关，和抗炎细胞因子白细胞介素-10、白细胞介素-15 的水平较低相关联，M2 与白细胞介素-10 和白细胞介素-7 的高表达相关[39-41]。趋化因子 MIP-1α 和 MIP-1β 在脊髓损伤后表达上调，在损伤周围区域中枢神经细胞保有表达，损伤后 24 h 在脊髓灰质检测到趋化因子 MIP-1α 和 MIP-1β[42]。

生理状态下一氧化氮维持组织血液循环，当其异常增多时，就可引起氧化损伤以及细胞凋亡。体内一氧化氮由一氧化氮合酶催化生成，其中诱导型一氧化氮合成酶通过直接引起过氧化损伤或作为信号介质介导细胞凋亡。诱导型一氧化氮合成酶特异性抑制剂氨基胍可明显改善大鼠脊髓损伤后后肢功能的恢复。脊髓损伤后诱导型一氧化氮合成酶表达增强，凋亡神经细胞大量出现，大剂量甲泼尼龙能抑制大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合成酶表达及细胞凋亡[43]。探讨脊髓损伤后细胞凋亡特点与诱导型一氧化氮合成酶表达规律，尤其是二者之间的关系对揭示脊髓损伤机制及指导临床治疗具有重要意义。

四、脊髓损伤后细胞凋亡的干预

细胞凋亡是生命的基本现象之一，可以发生在生理或病理条件下。形态学表现为胞膜对称性丧失、染色质凝集、细胞皱缩、DNA 破碎、线粒体肿胀和凋亡小体形成。细胞凋亡是脊髓损伤后引起神经功能障碍及影响疗效的主要原因。脊髓损伤后神经细胞凋亡是继发损伤期的重要病理变化，并有其时相和空间分布特点[44]。细胞凋亡和变性坏死同时存在于慢性压迫性脊髓损伤的病理过程中。减少促炎反应引起的组织损伤和细胞凋亡，神经保护[45-46]。抗凋亡药物，自由基清除剂和抗炎剂可以靶向中枢神经系统的炎症反应、抑制细胞凋亡，减少组织二次损伤，提高功能恢复。

脊髓损伤后趋化因子 CXCL10 上调，在 T-淋巴细胞募集和抑制血管生成中起关键作用，CXCL10 抗体可以减少炎症反应，促进血管生成。经 CXCL10 抗体治疗后TUNEL 阳性细胞数量减少 75%，减少细胞凋亡，增加脊髓损伤后轴突发生[47]。脊髓损伤后促凋亡蛋白 Bax 表达上调，Bax/Bcl-2 比率增加，caspase-3 上调，应用细胞因子信号-3（SOCS3）抑制剂可以抑制 SOCS3 mRNA 和 Bax 表达，抑制脊髓损伤诱导的神经元死亡和保护神经元形态，在调节脊髓损伤后的神经元死亡中起重要作用[48]。

干细胞因子腹腔内注射可以防止脊神经细胞凋亡。改善脊髓损伤后神经功能，在早期红细胞生成中起重要作用，可用于脊髓损伤的治疗[49]。从脂肪组织基质细胞（ATSCs）细胞质提取物减少 caspase-3 和 SAPK/JNK 活性，抑制线粒体细胞色素 c 释放和减少细胞中 Bax 蛋白表达水平，减少细胞凋亡，预防脊髓损伤后二次性损伤，促进神经功能[50]。

甲泼尼龙能有效地抑制脊髓损伤后炎症反应，抑制大鼠脊髓横断性脊髓损伤后的神经细胞凋亡，但不能推迟细胞凋亡出现的高峰时间[51]。鸟苷嘌呤核苷具有神经保护，抗凋亡和刺激神经再生作用，脊髓损伤后 4 h 经鸟苷嘌呤核苷 14 天连续给药后能显著促进运动和感觉功能恢复，改善膀胱功能，抑制炎症诱导的轴突，少突胶质细胞，神经元细胞凋亡，保护髓鞘[52]。西洛他唑是磷酸二酯酶抑制剂具有抗炎症反应，可以降低脂质过氧化反应，减少活性氧产生，但其对细胞因子释放和脊髓损伤后炎症反应没有明显的抑制作用[53]。

总之，脊髓损伤后存在两个缺血区域，一个区域紧靠损伤位点，该区域大部分神经元正在或者已经坏死或者凋亡，属于已经不可挽救区域；另一个区域离损伤位点比较远，紧靠第一个损伤区，该区域的神经元尚未发生凋亡或坏死，属于可挽救区域，因此如果能及时挽救该区域处于早期变性的神经元，便能在很大程度上缓解脊髓损伤，从而促进神经功能的恢复。

细胞凋亡现象存在于多种生物体中，在胚胎发育、免疫耐受、肿瘤发生及组织更新等过程中起重要调节作用。脊髓损伤后急性损伤主要表现为细胞的坏死，继发损伤主要由细胞的凋亡引起。细胞凋亡是慢性脊髓损伤继发病理变化的重要组成部分，细胞凋亡过程是一个非常复杂的病理过程，如何干预脊髓损伤后细胞凋亡成为脊髓损伤治疗的一个切入点。

近年来研究发现，细胞凋亡可受多种因素影响，其中细胞因子可影响细胞凋亡。细胞因子是传递细胞间信息的物质，细胞因子作为免疫炎性反应中基本的调控分子，它参与并调控脊髓损伤后的炎性反应。白细胞介素在机体抗感染、炎症和造血等生物学反应中发挥重要作用[54-57]。白细胞介素-6 具有广泛的免疫调节作用，是机体重要的促炎细胞因子。肿瘤坏死因子是一种多功能的细胞因子，它在炎症、脊髓损伤以及脊髓神经结扎等模型中起着重要作用。抑制脊髓损伤后促炎因子的表达，制定更有效的治疗靶点，以达到保护神经细胞，恢复神经功能，促进脊髓损伤后神经元修复和再生的作用。

参 考 文 献

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（本文编辑：李贵存）

DOI：10.3969/j.issn.2095-252X.2016.06.007中图分类号：R683.2

作者单位：100034 北京大学第一医院骨科（王诗军、李淳德），麻醉科（李钰婷）

通信作者：李淳德，Email: doctorli444@163.com

Corresponding author：LI Chun-de， Email： doctorli444@163.com

收稿日期：（2016-02-14）

The expression of cytokine after secondary spinal cord injury and its effects on cell apoptosis

WANG Shi-jun， LI Yu-ting， LI Chun-de.

Department of Orthopaedics， Peking University frsd Hospital， Beijing， 100034， PRC

【Abstract】Secondary spinal cord injuries are associated with infammation， excessive cytokine release， and cell apoptosis. Apoptosis is known as the main mode of delayed neuronal cell death after spinal cord injury and is mediated by a variety of pro-infammatory cytokines. Cytokines are important regulatory molecules that are involved in the regulation of immune and infammatory response and cell apoptosis after spinal cord injury. Interleukin-1（IL-1），interleukin-6（IL-6）， interleukin-8（IL-8）and tumor necrosis factor alpha（TNF-α）play an important role in spinal cord injury. IL-1β can lead to protein degradation and then induce cell apoptosis， the expression of IL-1β is increased after spinal cord injury， a peak of IL-1β expression is observed within 6h. The expression of TNF-α is increased after spinal cord injury which induce apoptosis in neurons and oligodendrocytes. A peak TNF-α expression is observed within 1 h after spinal cord injury， and TUNEL-positive cells are observed. After injection with TNF-α antagonist into the injured area， the expression of iNOS and the level of NO are decreased， and the number of TUNEL-positive cell are reduced. Inhibition of pro-infammatory cytokines expression can reduce cell apoptosis and infammatory responses in cells， that play a neuroprotective role in promoting neural repair and regeneration after spinal cord injury.

【Key words】Spinal cord injury； Spinal cord injury， secondary； Cell apoptosis； Cytokines； Neurons；Interleukins