脑缺血再灌注对血脑屏障紧密连接的影响

葛志强

脑缺血再灌注对血脑屏障紧密连接的影响

葛志强

血脑屏障（BBB）是机体内重要的防御结构之一，其能够限制水溶性及大分子脂溶性物质进入大脑，调节水、离子及大分子物质的转运，从而维持大脑内环境系统的稳定［1，2］。血脑屏障的构成包括：血管内皮细胞、内皮细胞间的紧密连接、基底膜以及星形胶质细胞足突。血管内皮细胞间的紧密连接（TJs）是血脑屏障维持结构与功能的重要基础。本文对脑缺血再灌注对血脑屏障紧密连接的影响综述如下。

1 紧密连接的分子构成

1.1 闭合蛋白（Claudin） Furuse等［3］1998年发现Claudins-1和Claudins-2，至今已经有至少24种闭合蛋白被发现。其是相对分子质量为22KD的蛋白质，有4个跨膜区域，是紧密连接的主要组成部分［4］。细胞膜外的闭合蛋白与相邻内皮细胞的闭合蛋白相结合，形成二聚体形式，类似“邦鞋带”样结构。闭合蛋白的羧端在细胞质内与ZO-1、ZO-2和ZO-3等胞质附着蛋白相连接。

1.2 咬合蛋白（occludin） 咬合蛋白于1993年被Furuse等［5］在鸡中发现，接着在1996年Akatsuka等［6］在哺乳动物中发现。它是相对分子质量为65KD的蛋白质，在氨基酸序列上与闭合蛋白无相似序列。与闭合蛋白一样，也包括4个跨膜区域，其两端（1个短的氨基端及1个长的羧基端）均位于胞质内。咬合蛋白在细胞质内的直接与ZOs蛋白相连。在细胞裂隙间两个相邻细胞的闭合蛋白和咬合蛋白的胞外区域形成的环形结构相连接，形成紧密连接的细胞旁屏障。正是由于这种特殊结构咬合蛋白对细胞旁的渗透调节起着重要作用［7］。

1.3 连接粘附分子（JAM） 连接粘附分子是跨膜蛋白的一种，Martin-Padura等［8］于1998年发现这类蛋白。属于免疫球蛋白（Ig）家族的成员，相对分子质量为40KD。其有一个跨膜结构，细胞外的部分由二硫键形成了两个环形。至今为止已经发现了JAM-1，JAM-2和JAM-3三种蛋白，而只有JAM-1和JAM-2在脑血管中有表达［9］。

1.4 胞质附着蛋白 胞质间附着蛋白包括闭锁小带蛋白-1、-2、-3（zonula occludens Z0-1、-2、-3）、cingulin、7H6和AF-6等蛋白。Z0-1、-2、-3相对分子质量为220KD、160KD、130KD，有着相似的氨基酸序列，均属于膜结合鸟苷酸环化酶激活蛋白家族。其有3个PDZ区域（PDZ1、PDZ2和PDZ3），1个SH3区域，一个鸟甘酸激酶（GUK）区域。PDZ结构域主要功能是参与细胞内的信号，细胞粘附，离子运输，形成细胞间屏障；SH3结构域和Ras蛋白、Src激酶等通过细胞骨架共同调节胞内信号传导［10］；GUK结构域具有ATP酶活性。闭锁蛋白富含脯氨酸的羧端与细胞骨架蛋白相连。这样闭锁蛋白就充当着连接跨膜蛋白到细胞骨架蛋白的中间蛋白。Cingulin位于细胞质内与ZOs蛋白、肌球蛋白、JAM-1和AF6相连接，因此Cingulin是紧密连接的一种重要的支架蛋白。Cingulin是通过传导肌动-肌球蛋白细胞骨架产生的收缩力，从而产生调节血脑屏障通透性的功能［11］。

1.5 细胞骨架蛋白 肌动蛋白（Actin）是相对分子质量为42KD，是一种中等大小的蛋白。肌动蛋白的多聚体形成肌动蛋白丝，称为纤维状肌动蛋白（F-actin）。肌动蛋白纤维对于血脑屏障紧密连接的稳定性有着重要的作用［12］。

2 脑缺血再灌注对紧密连接的影响

目前有研究表明大鼠脑缺血2h后occludin和Claudin蛋白及相应mRNA的表达开始下降，6h后达到最低，1d后开始升高，而血脑屏障的通透性与此呈负相关性［13］。孙伟等［14］认为缺血2h再灌注3hoccludin mRNA和蛋白的表达水平下调，再灌注24h达到高峰，72h开始减弱，且再灌注过程中occludin沿血管的表达由连续状态变得间断、乃至消失。Kago等［15］发现，在人工诱导的大鼠脑栓塞中，occludin和ZO-1的水平在栓塞后下降。吴丽文等［16］透过体外研究发现，缺氧5h后occludin和actin的蛋白表达量无显著变化，而ZO-1的表达显著减少。

目前对于缺血后occludin和Claudin表达变化，主流观点认为是表达下降，虽然下降的时间点有所不同，这可能是由于研究对象或条件等方面不同造成的差异所导致。还有一部分学者认为，血脑屏障通透性的增加，除缺氧后导致的紧密连接蛋白表达的减少，与一些蛋白的位置及结构的改变也有关系。如孙伟等［14］观察到再灌注过程中occludin沿血管的表达由连续状态变得间断、乃至消失。Fischer等［17］发现在缺氧时ZO-1和ZO-2蛋白由原来的细胞质向细胞核内转移，同时伴随着细胞旁通透性的增加。

有学者认为缺氧后细胞骨架蛋白的动态重组作用对于血脑屏障的调节有着重要的意义［18］。缺血后细胞质内actin蛋白的总量无明显变化，1h后在细胞膜检测到actin数量的上升，而6h后便回到正常水平。Wachtel等［19］发现缺血5h复氧2h后血脑屏障的功能完全恢复，在整个病理过程中主要是F-actin结构发生一系列的变化。

3 脑缺血再灌注导致紧密连接破坏的相关分子机制

3.1 蛋白质磷酸化信号转导途径 蛋白激酶C（PKC）在缺血再灌注的情况下对血脑屏障通透性的调节起着重要的作用。PKC同工酶类在血脑屏障中可以调节紧密连接蛋白的组装也能维持内皮细胞旁的完整性［20］。PKC能使肌球蛋白轻链和肌动蛋白磷酸化，从而导致内皮细胞收缩。有实验证实PKC抑制剂能通过多种途径降低内皮细胞间的渗透率［21］。

蛋白激酶A（PKA）能够维持细胞支架丝的稳定性，使肌球蛋白轻链去磷酸化，使F-actin从肌球蛋白上分离，以及增强细胞基质连接。PKA还能够抑制血小板聚集和白细胞粘附［22］，这可能能减轻缺血再灌注过程中炎症对血脑屏障通透性的不利影响。有体外实验表明缺血及再灌注导致的微血管通透性增加能被cAMP所逆转［23］。而cAMP的作用正是通过PKA介导完成的。

蛋白激酶G（PKG）在微血管通透性升高的细胞内信号转导中是重要的信号分子，其组成的Ca2+-NO-cGMP-PKG级联反应在微血管通透性的调节中起重要的作用。cGMP诱导细胞内骨架蛋白的应力性变化，继而增加内皮细胞的通透性。Wong等［24］研究结果显示，缺血再灌注导致的缓激肽、组胺、NO、TNFα、血小板活化因子、VEGF等的变化，可通过NO-cGMP途径导致细胞旁通透性的增加。通过抑制PKG可以减轻大脑血管内皮细胞缺氧压力下所导致的ZO-1 及ZO-2由细胞质向细胞核移位。

酪氨酸蛋白激酶（PTK）是细胞内信号传导分子，在缺血再灌注时能够调节内皮细胞旁的通透性。Occludin蛋白跨膜链上含有大量的酪氨酸，因此对酪氨酸的磷酸化特别敏感。缺血再灌注可导致细胞内occludin蛋白的磷酸化增加，使其和ZO-1、-2和-3的连接减少，最终导致血脑屏障的破坏［15］。而酪氨酸抑制酶可以减轻occludin磷酸化导致的血脑屏障的破坏以及梗死面积的增加［25］。

3.2 Ca2+信号转导 Ca2+是体内重要的第二信使，对细胞功能的维持起着重要的作用，细胞内钙离子水平通过细胞膜钙通道和钙泵精确调节到细胞外间隙或者细胞内内质网中。缺血再灌注过程中可引起细胞内Ca2+的增高，ATP减少，以及兴奋性氨基酸和NO的释放。而炎性反应也刺激血管内皮细胞中钙离子的浓缩［26］，这也许是导致再灌注过程中第二次钙波动的原因。细胞内钙浓度的升高主要是激活钙调蛋白依赖性激酶，细胞内钙浓度的变化能使ZO-1和肌动蛋白的结合发生变化，并导致occludin在细胞内的分布改变，从而使血脑屏障通透性增加。钙离子通道阻滞剂也证实了能够降低因缺血引起的血脑屏障的通透性增加［27］。

3.3 基质金属蛋白酶（MMPs）的活性 MMPs是一组含有Zn2+的依赖Ca2+的能够降解或修饰细胞外基质的蛋白酶，正常情况下以酶原形式存在，被控制在较低水平，当脑组织缺血及再灌注时，其活性明显增加。MMPs中以MMP-2和MMP-9的活性最强，成为近年来研究的热点。在中枢神经中血管内皮细胞、神经元细胞、胶质细胞和周细胞均能产出MMP-2和MMP-9酶原。MMP-2酶原能被MT-MMP激活，MMP-9能被MMP-3以及局灶性缺血产生的自由基激活。MMPs的作用和活性可以被一些炎性因子进一步放大［28］。

MMP-2在缺血再灌注血脑屏障破坏的初始阶段起着重要的作用。Yang等［29］通过原位酶谱法研究早期缺血的区域，发现MMP-2及MMP-9的活性均有增加，但是主要以MMP-2为主，进一步测定mRNA及MT1-MMP表明MMP-2在缺血初期的重要作用。缺血后再灌注3h导致的MMP-2及MMP-9上升使得claudin-5和occludin蛋白断裂后再重新定位，且这一现象可以被MMPs抑制剂所逆转。

MMP-9在缺血再灌注血脑屏障破坏的第二阶段起着重要的作用。与野生型小鼠相比，MMP-9基因敲除的小鼠在缺血再灌注后的血脑屏障破坏及脑水肿均明显减少［30］。先前认为MMP-9通过水解脑血管基底部的相关蛋白而导致血脑屏障的破坏，引起血管源性脑水肿的发生。最近研究发现，MMP-9能直接作用于紧密连接相关蛋白使其降解，这些蛋白包括occludin，ZO-1等。Occludin蛋白作为MMPS的作用底物，其中中含有MMP切割位点。对于MMP-9能否降解Claudin蛋白，目前仍有争论。Alexander等发现VEGF能激活MMP-9并增加血管通透性，而VEGF阻滞剂能降低血管通透性并能减弱缺氧导致的MMP-9活性增加［31］。

3.4 炎性介质 肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-1β （IL-1β）在炎症开始阶段引发了炎症的反应。TNF-α、IL-1β和IL-6能增加毛细血管内皮细胞的细胞旁通透性，而这一现象能被环加氧酶抑制剂所逆转［32］。TNF-α通过改变细胞骨架肌动蛋白的形态分布及减少ZO-1的表达量导致紧密连接蛋白的破坏。有学者对肠上皮紧密连接的研究发现，TNF-α增加细胞旁通透性的作用通过核因子kB（NF-kB）起作用，进一步通过抑制剂抑制NF-kB后发现，紧密连接的破坏有所改善，ZO-1的蛋白水平的减低和蛋白移位均不明显［33］。

白细胞介素-1（IL-1）对血脑屏障的破坏与其导致Occludin和ZO-1蛋白的减少有关。对肠上皮紧密连接的研究，IL-1能够降低Occludin蛋白的表达水平以及减少Occludin-mRNA的水平。另一项研究表明，IL-1的拮抗剂能显著减少24h缺血再灌注小鼠的脑梗死面肌及降低血脑屏障的通透性［34］。IL-6能够导致ZO-1的移位和肌动蛋白的重组，从而导致血脑屏障的破坏。IL-6基因敲除的小鼠肠上皮间隙通透性的增加与紧密连接蛋白ZO-1的稳定性破坏有关［35］。

单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/CCL-2）以及CCL-2受体（CCR-2）在缺血再灌注时显著升高。Dimitrijevic等［36］通过对血管内皮细胞和星形细胞共同培养创建的缺血再灌注的体外模型发现，血脑屏障通透性的增加伴随着CCL-2和CCR-2（CCL-2的受体）的增加以及紧密连接Claudin-5、Occludin和ZO-1的减少和形态的改变，进一步应用CCL-2抑制剂或CCR-2阻断剂均能够提高血脑屏障的通透性，缓解紧密连接蛋白的破坏。

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