骨髓炎骨缺损动物模型构建研究进展*

袁承杰　翁蔚宗　周启荣　苏佳灿**

（1.第二军医大学心理与精神卫生学系，上海200433；2.第二军医大学附属长海医院创伤骨科，上海200433）

骨髓炎骨缺损动物模型构建研究进展*

袁承杰1翁蔚宗2周启荣2苏佳灿2**

（1.第二军医大学心理与精神卫生学系，上海200433；2.第二军医大学附属长海医院创伤骨科，上海200433）

创伤性骨髓炎以及慢性难治性骨髓炎已经成为骨科常见疾病之一，该病治疗困难，病情迁延不愈，复发率和致残率高，同时创伤初期和慢性感染很可能导致骨缺损。近年来随着复合人工骨替代材料和生物载药系统的研究，感染性骨缺损的骨组织工程治疗方法不断深入，部分支架材料应用于临床实践。但新技术转化应用于临床实践需要进行临床前研究，如何更好地建立同质性动物模型对实验研究起至关重要的作用。优秀且标准的实验动物模型构建为研究者提供了控制各种影响因素的操作平台，有利于不同研究之间进行比较，继而为解决后续的临床实践应用提供第一手资料。本文主要对近年来骨髓炎骨缺损动物模型构建的相关研究进展作一综述。

骨髓炎；模型，动物；研究

【Abstract】Traumatic osteomyelitis and chronic osteomyelitis have been common diseases in orthopedics.The characteristics of osteom yelitis，such as delayed healing，high morbidity，and high recurrence rate contribute to its intractability.A lso，osteomyelitis tends to result in bone defects.In recent years，with the developmentof composite bone graft substitutes and biological deliver，bone tissue therapeuticmethods for the contaminated bone defect have stepped further，various scaffold materials have been app lied in clinic.How ever，pre-research is essential before new techniques are performed in clinic，and it is crucial for experimental researches to perform homogeneous animalmodelsbetter.An excellentanimalmodel is a platform for variable control，and also providesprimary data reference for clinic.Theaim of this review is to prospect the study progresson animalmodelsof bonedefects due to osteomyelitis.

【Key w ords】Osteom yelitis；M odel，Animal；Research

骨髓炎是由感染引起的骨组织急性或慢性炎症性疾病，常累及骨膜、骨密质、骨松质及骨髓组织，治疗棘手，而且静脉给药常会产生耐药性而难以彻底治，由于其伴有不同程度的感染和骨缺损，常常导致骨不连或骨不愈合，是骨科临床实践中的难题之一［1-3］。骨髓炎根据机体对感染的反应可以分为化脓性骨髓炎和肉芽肿性骨髓炎。根据被感染的机制，分为外源性骨髓炎和血源性骨髓炎，外源性骨髓炎由手术、开放性骨折或者由周围组织蔓延感染引起，血源性骨髓炎则由血液中的化脓性细菌感染引起。但骨髓炎发病机制复杂，且变异度高，所以上述分类方法难以应用于临床。目前对于骨髓炎病因和治疗方案的研究是矫形外科的研究热点之一。近年来，随着复合骨移植物和生物载药系统的研究和部分应用，为临床治疗各类急慢性骨髓炎以及骨缺损带来了希望［4］。同质性的动物模型在新技术转化为临床实践的过程中发挥了至关重要的作用，以往有多种动物模型曾被用于骨髓炎及骨缺损的相关研究，基于上述早期探索，这些模型可以应用于复合骨移植物临床实践前的论证研究，同时为控制不同影响因素提供了一个标准化平台。本研究回顾性分析近年来国内外骨髓炎动物模型构建的最新研究，并对此作出展望。

1　骨髓炎骨缺损动物模型构建的动物种类

在构建骨髓炎骨缺损动物模型时，实验动物需在解剖学和生理学特点上与人类相似，以符合慢性骨髓炎骨缺损的病变规律。常用的动物有新西兰大白兔、大鼠和小鼠，狗、猪和山羊较少使用。

在骨髓炎骨缺损动物模型构建的相关报告中，兔应用的较多，因其能较好地模拟人类骨髓炎的发生过程［5，6］。兔的大小合适，其骨尺寸可支持接骨板螺钉内固定的安置，常用的有兔胫骨模型、兔下颌骨模型、兔股骨模型等。大鼠也是构建骨髓炎骨缺损模型的常用动物，其具有体积小和价格经济的特点，并且其骨尺寸支持较小的髓内固定［7-9］。但由于其体型和解剖特点，大鼠模型限制了生物载药系统的移植研究。小鼠作为建模实验动物，曾应用生物发光体内成像检测技术在小鼠骨髓炎模型上实现了骨髓炎发生发展的实时动态连续监测。但同样由于其体型和解剖特点而限制了生物载药系统的移植研究。狗、猪、山羊等大型动物的手术耐受性较强，而且一些实验研究表明大型动物可以构建慢性、渐进性和相对比较稳定的骨感染和骨缺损模型［10］。

2　骨髓炎骨缺损动物模型的细菌种类

2.1金黄色葡萄球菌

临床上骨髓炎以金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）感染最为常见，因此在骨髓炎骨缺损动物模型构建中，SA常作为首选细菌［11-13］。先前大量研究中SA的来源有所不同，有相当数量的相关研究使用来自于骨髓炎感染灶中的强致病性SA，例如Lucke［14］在难治性慢性骨髓炎患者体内分离出对青霉素耐药的强致病性SA；常用的致病性SA菌株为分离自慢性骨髓炎患者感染灶内的ATCC49230；更多研究使用的SA菌株为非取自患者感染灶的美国模式培养物集存库（ATCC）菌株，常用的包括ATCC29213、ATCC33591、ATCC25923、ATCC49525等。Xing等［15］用3mm克氏针在新西兰兔胫骨结节处钻孔注入ATCC25923，4周后即出现死骨形成、骨膜反应、骨质破坏、骨硬化、软组织肿胀等骨髓炎表现。Williams等［16］利用模拟羊胫骨近端的Gustilo-ⅢB型开放骨折，同时使用涂有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）生物膜接骨板作为内固定建立模型。同时，李云飞等［17］利用MRSA悬浮液诱导40例新西兰大白兔胫骨近端感染以构建骨髓炎模型，其中37例出现典型骨髓炎影像学表现，模型构建成功率为92.5%。褚立涛等［20］利用浓度为3×106CFU/m l的ATCC25923悬浮液对42只大白兔进行胫骨创伤后骨髓炎模型构建，其中38例建模成功，成功率达到91%。在骨髓炎动物模型构建的过程中，还有其他因素如局部缺血、开放性伤口、菌液浓度等会影响模型构建的成功率，但目前的研究表明SA构建骨髓炎动物模型的成功率较高。

2.2铜绿假单胞菌和大肠埃希菌

临床实践中还可见其他细菌如铜绿假单胞菌或大肠埃希菌感染。大肠埃希菌感染所致骨髓炎的致病菌往往来自于患者自身，可能与应激状态下肠道粘膜缺血所致屏障功能减弱有关。为了验证铜绿假单胞菌是否能够诱导骨髓炎，Kanellakopoulou等［18］在36只新西兰大白兔胫骨上段接种来自于从慢性骨髓炎患者感染灶中分离出来的铜绿假单胞菌，以此为基础构建铜绿假单胞菌骨髓炎动物模型，2周后全部动物出现局部肿胀体征，但49 d后只有25只出现骨感染并伴有死骨和死腔窦道流脓表现，而其余11只无明显骨感染表现。该研究表明铜绿假单胞菌可以诱导产生骨髓炎模型，但成功率并不高。另外也有学者对大肠埃希菌致骨髓炎的能力进行了研究，如Passl等［19］用电锯截断7只豚鼠股骨，然后接种浓度为1×105CFU的大肠埃希菌，4周后全部豚鼠出现明显的骨感染表现，90 d后检查发现6只豚鼠无细菌感染，只有1只豚鼠有大肠埃希菌和铜绿假单胞菌混合感染，可见大肠埃希菌诱导骨髓炎模型的效能不高，但是局部炎症反应和内毒素的作用可使其他细菌的侵袭性增强继而出现混合感染。

2.3其他细菌

除此以外，研究中用到的细菌还有厌氧菌和鲍曼不动杆菌，但其致骨髓炎效果不强，造模成功率低。

3　骨髓炎骨缺损模型的构建

骨髓炎骨缺损模型的构建主要包括创伤、接种细菌、内固定、缺损量化、术后检测等内容［20］。同时需要注意创伤方式，接种细菌浓度，内固定方式选择等问题。动物骨髓炎模型按照形成方法分有静脉注射模型、局部注射（接种）模型、生物载药系统模型、创伤骨折模型。Patel等［21］采用骨髓细菌接种和硬化剂封闭等方法成功构建了骨髓炎模型，发现细菌和异物是造模成功的2个重要条件。但是以上方法都有其局限性，难以解决骨缺损和骨感染两者交互作用影响的问题。为此，在构建骨髓炎骨缺损动物模型时，需要考虑接种方法、内固定、骨缺损量化等影响感染发生因素的问题。

3.1骨缺损部位及其量化指标

构建骨髓炎模型时需要考虑造模部位。非负重骨模型常使用下颌骨和颅骨，负重骨模型常使用股骨以及胫骨［22］。既往研究表明不同部位骨缺损后的骨愈合差别显著，可能是由于不同骨的骨膜存在生理差异。单纯骨缺损模型的量化指标涉及到缺损临界值，其采用的是长骨骨缺损的临界值，骨缺损超过该值被认为难以自然愈合。但这并不适用于骨髓炎所致骨缺损的量化研究［23］，因为除缺损临界值外，影响骨髓炎骨缺损的因素还包括接种浓度、接种细菌类别、接种方式、糖尿病、高血压、肿瘤等因素。因此在构建和研究骨髓炎骨缺损模型时需要充分考虑上述因素。即使保证同菌株、同浓度、同方法、同部位也难以保证造模的差异性很小，故骨髓炎骨缺损研究难以量化比较，后续研究更需要探究可以用于量化的指标。

3.2接种细菌的方式和浓度

文献报道目前接种细菌的方法主要有静脉全身注射法、骨髓腔钻孔局部注射法、骨滋养动脉局部注射法［24］。接种细菌浓度的选择直接影响骨髓炎骨缺损模型的构建。静脉全身注射法接种细菌因为死亡率较高和模型构建成功率较低而目前较少应用。Pouhsides等［25］通过将金黄色葡萄球菌直接注射到股动脉来建立新的骨髓炎模型，结果发现高浓度（5×108个菌落数）会导致实验动物100%的死亡率。而浓度降低后则不能得到稳定的感染结果，进一步说明了应用动脉注射全身接种方法建立该模型的难度。除了注射接种细菌，另一种方法为异物浸泡细菌悬液后植入骨髓腔。Schulz等［26］通过活检针取出1m l骨髓，然后将0.1m l5%鱼肝油酸钠和0.1m l葡萄球菌悬液注入髓腔，并且将活检针头植入髓腔内，研究发现所有实验动物均发生骨髓炎，同时应用硬化剂是模型成功的关键。Horn等［27］制备兔胫骨感染性骨缺损模型时，使用4×104菌落形成单位（Colong form ing units，CFU）的SA，所有的动物均未形成感染；当使用6×106CFU的SA，所有动物均出现严重的骨感染症状。Chen等［30］在大鼠股骨制造6mm骨缺损后，分别局部接种1×103、1×104、1×105、1×106CFU的SA，接种2个月后只有1×104CFU组能较好地形成节段性骨髓炎骨缺损模型且不影响内固定装置的稳定性，4周后1×105、1×106CFU组的固定装置稳定性受到明显影响，1×103CFU组的感染率较低。但Lindsey等［28］研究发现，大鼠股骨接种细菌量在1×102CFU的SA即能达到理想的90%～100%的感染率且不会发生败血症，说明接种浓度对骨髓炎骨缺损动物模型的构建影响不大。该研究认为细菌通过其产物改变微环境从而影响接种细菌的增值，继而对骨髓炎模型构建的成功率产生影响。故有关于接种细菌悬液的浓度对骨髓炎骨缺损动物模型的构建是否存在明显影响还有待后续研究。

3.3骨髓炎骨缺损模型构建后的检测

骨髓炎骨缺损模型构建完成后，术后检测是判断造模是否成功以及骨缺损严重程度的重要指标。常用的检测方法包括生化指标、细胞学、影像学、微生物学和组织学结果。近年来随着核医学的兴起，显微PET-CT开始用于骨髓炎骨缺损模型的术后检测，其优点是能早期发现骨感染，对感染的特异性强［29］。普通显微CT在无创条件下能够很好地呈现植入材料中的骨生长以及血管重建，无需处死动物，可重复多次进行，保证了实验的连续性，减少了实验动物的数量。Dem irev等［30］比较MRI和PET-CT对于活动期骨髓炎的早期发现能力，发现PET-CT在第3周就能发现骨感染，且能够评价骨髓炎骨缺损模型的治疗效果，两者结合使用能对骨髓炎的发生发展有更加全面的把握和判断。C反应蛋白（CRP）作为重要的炎症反应指标常用于骨髓炎骨缺损动物模型构建后的检测。CRP相比红细胞沉降率（ESR）和白细胞计数更加敏感，可用于化脓性骨髓炎的诊断及疗效判定［31］。细胞学检查如白细胞计数和中性粒细胞计数检查有一定的意义，但骨髓炎发生时血白细胞计数可正常，故敏感性不高。对于无法区别的感染或者缺损，在构建骨髓炎动物模型后可通过手术活检的办法确定类别。

4　影响骨髓炎骨缺损动物模型构建的因素

在构建创伤性骨髓炎骨缺损动物模型时，常需要造成开放性骨折，为避免外源性微生物感染从而干扰造模，开放性伤口需要及时清创。有学者研究发现，早期清创能减少细菌在组织上的黏附量，2 h内清创并进行抗生素治疗能有效减少黏附在骨的细菌数量，而24 h后无论是否应用抗生素治疗，效果无显著差别［32］。另外，构建骨髓炎骨缺损模型时需要用骨蜡封闭骨髓腔钻孔，骨蜡相当于一种异物，为细菌的繁殖生长提供了黏附条件，同时骨蜡封闭阻止了细菌外漏从而促进骨髓炎生成。常用的硬化剂5%鱼肝油酸钠由于其血管闭合作用和促局部血栓形成作用，导致局部骨组织缺血，从而发生骨无菌性坏死［33］。故骨蜡和硬化剂的使用是影响骨髓炎骨缺损发生发展的重要因素。同时在手术操作过程中，开放性骨折导致异物进入断端，异物为细菌的增殖生长提供了黏附面，从而使其形成生物膜，削弱了宿主的免疫系统对机体的保护作用。

5　骨髓炎骨缺损动物模型构建研究的展望

随着慢性骨髓炎骨缺损研究成为骨科疾病研究中的热点，越来越多的临床医师和学者参与到该疾病的研究中来，以期建立标准的骨髓炎骨缺损动物模型，从而为后续深入的研究打下基础，也为临床治愈各类骨髓炎骨缺损提供客观有力的指南。今后的研究应该注重以下几点：①目前骨髓炎的相关治疗研究主要集中在抗生素的局部应用和控释方面，以后应进行更多的新型复合人工骨替代材料以及生物材料支架的应用研究；②大型动物（如羊、狗等）因其饲养、花费问题而较少应用，但其骨关节尺寸更接近人类，且手术耐受性强，可以植入较大的生物材料，今后应构建更多的大型动物骨髓炎骨缺损模型；③随着影像学技术的发展，显微PET等新型核医学影像检测手段可以应用于骨髓炎骨缺损动物模型的研究；④根据骨髓炎骨缺损的发病机制，今后研究中可以更多地引入分子水平的研究内容，实现精准医学的研究目标。

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Research progresson animalmodelsof bone defectsdue to osteomyelitis*

YUAN Chengjie1，WENGWeizong2，ZHOUQirong2，SU Jiacan2**
（1.Faculty of Psychologicaland MentalHealth，Second M ilitary MedicalUniversity，Shanghai200433；2.Departmentof Traumatology and Orthopedics，ChanghaiHospital，Second M ilitary MedicalUniversity，Shanghai200433，China）

2095-9958（2016）02-0087-04

10.3969/j.issn.2095-9958.2016.01-18

国家自然科学基金面上项目（31271031）；国家自然科学基金国际重大合作项目（8141101156）；上海市科委基础重点项目（11JC14163020）

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苏佳灿，E-mail：jjiacansu@126.com