青南高原人体棘球蚴mtDNA基因多态性分析*

赵海龙，曹得萍，黄　欣，白海燕，李　伟，廖　博

(1.青海大学医学院病原生物学教研室；2.青海大学医学院实验诊断学教研室；

3.青海大学畜牧兽医科学院；4.重庆医科大学第二临床学院)



青南高原人体棘球蚴mtDNA基因多态性分析*

赵海龙1，曹得萍1，黄欣2，白海燕1，李伟3，廖博4

(1.青海大学医学院病原生物学教研室；2.青海大学医学院实验诊断学教研室；

3.青海大学畜牧兽医科学院；4.重庆医科大学第二临床学院)

摘要目的检测分析青南高原人体棘球蚴mtDNA基因型。方法对从青海玉树、果洛、海南、黄南藏族自治州收集的63个人体棘球蚴分离株，运用线粒体DNA的cox Ⅰ、nad Ⅰ、atp6 基因的特异性引物进行PCR扩增，对线粒体DNA特异目的片段进行序列分析鉴定。结果1)63个人体细粒棘球蚴分离株均为普通羊株(G1)；2)结果所得的9个基因型中有3个为青南高原地区所特有的基因型。结论本研究结果显示青南地区细粒棘球绦虫具有广泛性和普遍性的流行病学特征；同时青南高原又存在细粒棘球绦虫独特的核苷酸变异。

关键词青南地区高原人体棘球蚴基因多态性

ANALYSIS ON mtDNA POLYMORPHISM OF HUMAN

ECHINOCOCCOSIS IN SOUTHERN QINGHAI PLATEAU*

Zhao Hailong1，Cao Deping1，Huang Xin2，Bai Haiyan1，Li Wei3，Liao Bo4

(1.Department of pathogenic biology，Qinghai University Medical College，Xining 810001，China；

2.Department of experimental diagnostics，Qinghai University Medical College，Xining 810001，China；

3.Animal husbandry and Veterinary College of Qinghai University，Xining 810016，China；

4.The second clinical college of Chong Qing Medical University，401331，China)

Abstract ObjectiveDetection and analysis of the human Echinococcus mtDNA genotype in southern plateau of Qinghai Province.Methods The sample were collected fromYushu，Guoluo，Hainan and Huangnan Tibetan Autonomous Prefecture of Qinghai Province.63 cases of human hydatid isolated strains were amplified by PCR using primers specific for the mitochondrial DNA(mtDNA cox Ⅰ，nad Ⅰ，Atp6 )and the mitochondrial DNA specific fragment sequence was analysed and identificated.Results1)63 human Echinococcus granulosus isolates were common sheep strain(G1)；2)Among nine genotypes there were three specific genetypes in southern Qinghai Plateau.Conclusion The results of this study show that there have the general epidemiological characteristics of Echinococcus granulosus in south Qinghai area.At the same time，Echinococcus granulosus in southern Qinghai Plateau has its unique nucleotide variations.

KeywordsSouthern QinghaiPlateauHumanEchinococcosisGenetic polymorphism

在细粒棘球绦虫虫株鉴定和系统发生研究中，线粒体DNA(mtDNA)基因被广泛应用，而且mtDNA也用于检测细粒棘球绦虫属的遗传变异[1]。细粒棘球绦虫线粒体基因组为13588 bp，包括cox Ⅰ-cox Ⅲ基因，nad Ⅰ-nad Ⅵ基因和atp6基因[2，3]。将采自不同地区棘球蚴的mtDNA测序，得到10个基因型不同的地理株(G1-G10)，各虫株的宿主类别和地理分布存在差异[4]。

青海南部高原区位于昆仑山脉和唐古拉山脉之间，占青海省总面积的52%，属典型的高原大陆型气候，大部分地区海拔在4000～5000 m以上。区域内河流从多，冰川广布，耕地极少，草原广阔，植被多由高寒灌丛草甸、高寒草甸、高寒草原、高寒荒漠草原组成，当地居民95%以上是藏族，主要从事牧业生产。以往调查数据显示，该地区人和动物棘球绦虫感染严重，属重度流行区[5][6]。

对于青海省细粒棘球绦虫基因多态性的分析，1994年，McManus，D.P.et al[7]运用PCR-限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)技术对收集的青南地区10个人体棘球蚴分离株和38个牦牛棘球蚴分离株检测，没观察到任何核苷酸位点突变；2005年，Yang，Y.R.et al[8]运用线粒体DNA的atp6基因对收集的青南地区12个牛棘球蚴分离株和13个绵羊棘球蚴分离株检测，发现少量基因突变位点，但此项研究未涉及人体棘球蚴分离株的基因多态性检测。为全面了解青海青南地区人细粒棘球蚴基因多态型，本研究收集了63个人体棘球蚴分离株，运用线粒体DNA的cox Ⅰ、nad Ⅰ、atp6基因，对线粒体DNA特异目的片段进行序列分析鉴定。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1标本的采集

从2008年至2013年，研究组从玉树、果洛、海南、黄南藏族自治州医院收集细粒棘球蚴病人手术后标本，以同一个宿主的包囊为1个分离株样品，无菌条件下用注射器抽取囊液，显微镜下观察有无原头蚴，若有，用95%的酒精固定，-20 ℃保存；若无，则取少量囊壁组织，用95%的酒精固定，-20 ℃保存备用。共收集标本63份，女性37份，男性26份；玉树21份，果洛18份，黄南11份，海南13份；藏族58份，汉族5份；牧民49份，干部7份，学生4份，农民2份，僧侣1份； 年龄最大者72岁，最小者14岁。

1.1.2试剂与仪器

1.1.2.1试剂

DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic Kit，TIANGEN，Mennheim)，脱氧核苷三磷酸(dNTPs)(Thermo Scientific)，Taq DNA聚合酶(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)，引物(Invitrogen LifeTechnologies，Paislay，Scotland)。

1.1.2.2仪器

电泳仪(Power PAC 300 )，电泳槽(DYCP-31DN)，PCR扩增仪(SelectCycler II)。

1.2方法

1.2.1DNA提取

按试剂盒说明书操作步骤进行操作。

1.2.2引物选择(表1)

(1)线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(cox Ⅰ)基因；(2)线粒体NADH脱氢酶Ⅰ(nad Ⅰ)基因；(3)线粒体 (atp6)基因。

表1线粒体DNA引物序列及反应条件

Table 1 Primer sequences and PCR conditions for the amplification of the three mitochondrial markers

1.2.3PCR的扩增和测序

设置体积为25 μL的反应体系：10×Taq PCR MasterMix 2 μL，100 μmol的dNTP 2 μL，20 pmol·μL-1的S1、S2引物各1 μL，Taq 聚合酶2.5 μL，基因组DNA 2 μL，蒸馏水补足体积。cox Ⅰ、nad Ⅰ基因扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。atp6基因扩增条件：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸5 min。

1.2.4DNA序列的测定、排序与比较

对三种引物扩增的PCR 产物纯化回收，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。用DNAstar软件的Bioedit software程序对所得DNA序列排序，对同一基因序列做比较和分析，将获得的cox Ⅰ、nad Ⅰ、atp6基因序列与GenBank中的细粒棘球绦虫普通羊株(G1)线粒体完整的DNA序列(AF297617)、多房棘球绦虫的线粒体完整的DNA序列(AB018440)中的相应区域作同源性比较。

1.2.5系统发育树的构建

将同一个分离株的cox Ⅰ 和nad Ⅰ相加后，同细粒棘球绦虫完整的mtDNA序列(AF297617)、多房棘球绦虫完整的mtDNA序列(AB018440)一起输入MEGA.3.1，利用Neighbor-joining 法[9]获取距离矩阵。依据各距离值间的内在关系构建系统发育树，鉴定分离株基因型。

2结果

所测的63个细粒棘球蚴分离株均为普通羊株(G1型)。同GenBank中的普通羊株(G1型)比对，其基因同源性达到90%以上。

2.1coxⅠ基因序列

将扩增出的长度为396 bp的cox Ⅰ基因序列同GenBank中的细粒棘球绦虫普通羊株(G1型)完整的mtDNA序列(AF297617)的cox Ⅰ基因序列对应区域比对，发现有5个位点的核苷酸发生置换(表2)。将63个分离株的cox Ⅰ DNA序列在BioeDit中归类为4个基因型；cox Ⅰ A：6个分离株在7220位点T被C置换，7355位点G被T置换；cox Ⅰ B：37个分离株在7220 位点T被C置换；cox Ⅰ C：12个分离株在7220 位点T被C置换，在7175位点C被T置换，在7366位点T被C置换；cox Ⅰ D：8个分离株分别在7175位点C被T置换和7220位点T被C置换，显示了基因突变。

表2青南高原63个人体细粒棘球蚴分离株cox Ⅰ基因序列与普通羊株(G1)基因型线粒体DNA完整序列

(Genbank 收录号为：AF297617)比较结果

Table 2 Comparison of the Cox Ⅰ sequences obtained from 63 human isolates of Echinococcus granulosus

2.2nad Ⅰ基因序列

将扩增出的长度为418 bp的nad v基因序列同GenBank中的细粒棘球绦虫普通羊株(G1型)完整的mtDNA序列(AF297617)的nad Ⅰ基因序列对应区域比对，发现有2个位点的核苷酸发生置换(表3)。将63个分离株的nad Ⅰ DNA序列在BioeDit中归类为以下4个基因型；nad Ⅰ A：30个分离株的核苷酸序列与GenBank中的G1基因型完整的mtDNA序列(AF297617)nad Ⅰ基因相应区域完全一致；nad Ⅰ B：14个分离株在5068位点T被C置换；nad Ⅰ C：12个分离株在4883位点A被G置换；nad ⅠD：7个分离株在4883位点A被G置换和5068位点T被C置换。

2.3atp6基因序列

将扩增出的长度为513bp的atp6基因序列同GenBank中的细粒棘球绦虫普通羊株(G1型)完整的mtDNA序列(AF297617)的atp6基基因序列对应区域比对，发现有3个位点的核苷酸发生置换(表4)。将63个分离株的atp6的DNA序列在BioeDit中归类为以下3个基因型：atp6 A：37个分离株的核苷酸序列与GenBank中检索到的G1基因型线粒体DNA完整序列(AF297617)atp6基因相应区域完全一致；atp6 B：14个人分离株在3438位点G被A所置换；atp6 C：12个分离株在3420位点T被C置换和3457位点G被A置换。

表3青南高原63个人体细粒棘球蚴分离株nad Ⅰ基因序列与普通羊株(G1)基因型线粒体DNA完整序列

(Genbank收录号为：AF297617)的比较

Table 3 Comparison of the Nad Isequences obtained from 63 human isolates of Echinococcus granulosus

表4青南高原63个人体细粒棘球蚴分离株atp6基因序列与普通羊株(G1)基因型线粒体DNA完整序列

(Genbank 收录号为：AF297617)的比较结果

Table 4 Comparison of the Atp6 Isequences obtained from 63 human isolates of Echinococcus granulosus

把相同突变位点分离株的cox Ⅰ、nad Ⅰ和atp6基因序列相加，共计1327 bp。在普通羊株(G1)种内得到了9个基因型G1Q1、G1Q2、G1Q3、G1Q4、G1Q5、G1Q6、G1Q7、G1Q8和G1Q9，(图1)。利用Neighbor-joining 法得到9个基因型与G1线粒体DNA序列(AF297617)和多房棘球绦虫线粒体DNA序列(AB018440)之间的系统发育树。

本研究对63个人体棘球蚴分离株测序比对，共得到9个基因型。经过与GenBank上已发表的序列相比，其中G1Q3、G1Q4、G1Q5、G1Q6、G1MQ8和G1Q96个基因型已见报道[10，11]。其余的3个基因型G1Q1、G1Q2和G1Q7，在GenBank中没有一条DNA序列与它们有100%的同源性，基因型为青南高原地区所特有。

图1青南高原细粒棘球绦虫G1型种内9个基因型(G1Q1-G1Q9)的线粒体DNA基因序列与GenBank发表的细粒棘球绦虫普通羊株(G1型)线粒体DNA完整序列(AF297617)和多房棘球绦虫线粒体DNA完整序列(AB018440)的比较图

Figure 1The dendrogram shows the genetic distances separating the 9 genotypes (G1Q1 to G1Q9) identified in this study using coxI， nadI and atp6. EgG1 is the complete mitochondrial genome of the E. granulosus sheep strain (AF297617) and outgroup Em is the complete mitochondrial genome of E. multilocularis (AB018440)

3讨论

本研究结果显示流行于青南地区细粒棘球绦虫的基因型既具有其他流行地区的普遍性，又存在本地区独特的变异基因型特征，细粒棘球绦虫mtDNA在青南地区呈现出多态性分布的特点。通过基因水平对细粒棘球绦虫的测序分型，为今后棘球蚴病诊断试剂、疫苗及抗虫药物的研发奠定了分子生物学基础，并对制定合理的预防措施具有一定意义。

细粒棘球绦虫在青南高原地区广泛流行，是一种常见的危害严重的人兽共患寄生虫病。青南高原地处青藏高原腹地，位于昆仑山脉和唐古拉山脉之间，平均海拔在4000～5000 m之间，该地区有着独特的地理地貌，由山系和河川形成了与其它地域明显的地理隔离。青南高原地域广袤，存在完成棘球绦虫生活史的多种动物，而且数量繁多，形成两种棘球绦虫生活史型，即在人类居住区以家养食肉动物(犬、流浪犬)动物和家养食草动物(牦牛、藏羊)间形成畜牧型生活史；在人迹罕至的荒漠地区以野生食肉动物(狼、狐)动物和野生食草(多为偶蹄类)动物间形成荒漠型生活史。两种类型的生活史可各自独立循环，偶有交叉。由此推测，青南高原特有的地理隔离，形成的生殖隔离为细粒棘球绦虫的基因变异提供了条件，而当地丰富的动物资源为棘球绦虫的基因变异提供了物质基础。

本次测序的人体棘球蚴分离株来源于畜牧型生活史中的一个环节，相对于种类和数量庞大的荒漠型生活史，或其中存在更多的未知变异，有待今后进一步的工作证实。

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收稿日期2015-03-09

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.04.003

中图分类号R38

文献标识码A

*：教育部春晖计划项目(No．Z2010064)

赵海龙(1970~)，男，汉族，山西籍，硕士，副教授