新生大鼠缺血缺氧性脑损伤组织中HAX-1、Caspase-3、bcl-2表达变化及意义

黄海英，陈尚明，赵建美(南通大学附属医院，江苏南通226001)

新生大鼠缺血缺氧性脑损伤组织中HAX-1、Caspase-3、bcl-2表达变化及意义

黄海英，陈尚明，赵建美
(南通大学附属医院，江苏南通226001)

摘要:目的观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤( HIBD)组织中血细胞特异蛋白1相关蛋白X-1( HAX-1)、Caspase-3、bcl-2的表达，并探讨其意义。方法128只大鼠随机分为观察组和对照组各64只，观察组采用Rice法制备HIBD模型，对照组仅分离左侧颈总动脉不结扎。分别于造模后0、2、6、12、24、48、72 h断头取脑，采用Western blot法检测大脑皮层HAX-1、Caspase-3、bcl-2蛋白。结果与对照组同时点比较，观察组HAX-1于造模后6、12、18、48 h表达升高，Caspase-3于造模后6、12、18 h表达升高，bcl-2于造模后2、6、12 h表达升高，P均＜0.05;观察组造模后12、18 h的HAX-1的表达水平均高于造模后6 h，P均＜0.05。结论新生大鼠HIBD模型大脑皮层中存在HAX-1、Caspase-3、bcl-2高表达，三者共同参与了HIBD的发生、发展。

关键词:缺血缺氧性脑损伤;血细胞特异蛋白1相关蛋白X-1;凋亡蛋白; B淋巴细胞瘤/白血病2基因

新生儿缺血缺氧性脑损伤( HIBD)是导致儿童神经系统损伤和残疾的最常见原因［1，2］，其发生机制目前尚未明确。血细胞特异蛋白1相关蛋白X-1( HAX-1)是一种抗凋亡基因［3］，研究发现其在脑出血、创伤性脑外伤［4］、多囊肾［5］、系统性红斑狼疮［6］、银屑病［7］、中性粒细胞缺乏症［8］等疾病的发生、进展过程中起重要作用。但是，目前对于HAX-1在HIBD脑损伤中的作用尚未见报道。2012年9月～2013年2月，我们观察了HIBD大鼠大脑皮层中HAX-1、Caspase-3、bcl-2的表达，旨在探讨三者在HIBD发生、发展中的作用。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物与试剂动物: 7日龄清洁级SD大鼠128只，雌雄不限，体质量12～18 g，由南通大学实验动物中心提供。试剂: ITC标记的羊抗小鼠IgG (北京中杉)，Cys标记的兔抗小鼠IgG (北京中杉)，HAX-1单克隆抗体( BD)，DAB试剂盒( DAKO)，ELC化学发光试剂盒(碧云天生物技术研究所)，3-磷酸甘油醛脱氢酶( GAPDH，Sigma)，Caspase-3、bcl-2试剂( R＆D)。

1.2动物分组与造模处理128只大鼠随机分为观察组和对照组各64只，观察组采用Rice方法［9］制备HIBD模型。造模后2.5 h采用Longa评分法［10］行神经行为缺损评分，2～3分视为造模成功。死亡12只，最终造模成功52只。对照组仅分离左侧颈总动脉，不做结扎处理，其余处理同观察组;死亡11只，最终观察53只。

1.3大脑皮层HAX-1、Caspase-3、bcl-2蛋白表达检测两组分别于造模后0、2、6、12、24、48、72 h各处死7～8只，断头取脑。在解剖显微镜下剥脱脑膜，取出海马CA1区对应大脑皮层，连续冠状切片，片厚4 mm。采用Western blot法检测大脑皮层HAX-1、Caspase-3、bcl-2蛋白，实验步骤严格按试剂盒说明进行。以GAPDH作为内参，采用Quantity-one软件计算各样品蛋白表达水平，进行相对表达量分析。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，采用单因素方差分析和q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

两组各时点大脑皮层HAX-1、Caspase-3、bcl-2蛋白相对表达量比较，见表1。

3　讨论

据统计，HIBD存活者25%～30%可能有不同程度的后遗症，严重影响患儿的生活质量［11，12］。目前，HIBD的发病机制仍未明确，但神经元细胞的破坏和凋亡是当前研究的热点［13］。

HAX-1基因位于染色体1q21.3，是新近发现的抗凋亡基因之一，其结构与bcl-2蛋白家族的BH1、BH2结构域相似。bcl-2家族是调节细胞凋亡的一

表1　两组各时点大脑皮层HAX-1、Caspase-3 及bcl-2蛋白相对表达量比较(±s)

表1　两组各时点大脑皮层HAX-1、Caspase-3 及bcl-2蛋白相对表达量比较(±s)

注:与对照组同时点比较，#P＜0.05;与观察组造模后6 h比较，▲P＜0.05。

组别　n HAX-1　 Caspase-3　bcl-2观察组52造模后0 h　9.60±0.82　 5.68±0.49　 28.20±2.68造模后2 h　9.70±0.44　 5.72±0.64　 39.20±2.20#造模后6 h　13.30±1.01#18.60±1.88#18.18±1.68#造模后12 h　 16.40±1.45#▲19.44±2.05#17.66±1.77#造模后18 h　 26.80±2.20#▲14.22±1.87#23.33±2.14造模后48 h　 13.88±1.76#　6.11±1.05　 25.44±2.22造模后72 h　 13.21±1.25#　6.25±1.14　 29.88±2.55对照组　53造模后0 h　9.87±0.82　 5.70±0.49　 24.20±2.04造模后2 h　9.96±0.78　 5.66±0.54　 25.20±2.20造模后6 h　10.10±0.84　 5.83±0.88　 23.18±1.98造模后12 h　 10.33±0.85　 6.22±1.05　 25.66±1.77造模后18 h　 10.66±0.92　 6.08±1.14　 26.33±2.14造模后48 h　9.55±0.80　 6.01±1.15　 20.44±2.22造模后72 h　9.60±0.72　 6.34±1.24　 21.88±2.55

种重要蛋白，bax能够促进凋亡［14］，同时bcl-2能阻止凋亡的发生。HAX-1可通过抑制bax蛋白的激活，达到抗凋亡的作用，进而抑制Caspase-3的活性，起到抗凋亡的作用［15］。本研究发现，HAX-1与bcl-2的表达高峰存在时间差异，可能与残存神经元增加HAX-1表达有关。HAX-1通过其抗凋亡的作用，延缓神经元凋亡;而残存的神经元亦通过增加HAX-1表达，从而减轻或缓和幼鼠HIBD造成的脑损伤，两者可能存在正反馈调节机制。本研究发现，观察组大脑皮层HAX-1和Caspase-3的表达趋势均为先升高后降低，其中HAX-1表达高峰在造模后18 h，而Caspase-3的表达高峰在造模后12 h。其原因可能为缺血缺氧条件下，神经元的凋亡和抗凋亡共同存在。细胞凋亡过程中Caspase-3能剪切HAX-1，下调HAX-1的表达;同时HAX-1亦可抑制Caspase-3的活化，两者存在反馈性调节机制［9］，且损伤12 h之前，Caspase-3占主导性优势;而损伤18 h后HAX-1的主导优势越来越强。

综上所述，新生大鼠HIBD大脑皮层中存在HAX-1、Caspase-3、bcl-2异常表达，三者共同参与了HIBD的发生、发展。

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收稿日期:( 2014-12-05)

通信作者:赵建美

文章编号:1002-266X( 2015)30-0030-02

文献标志码:A

中图分类号:R364.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.011