饥饿对大鼠大脑皮质自噬相关蛋白LC3、Beclin 1表达的影响

褚迎欣，张建凯，程光，张树波，高晓增，刘铁军，张小平(华北理工大学附属医院，河北唐山063000)

饥饿对大鼠大脑皮质自噬相关蛋白LC3、Beclin 1表达的影响

褚迎欣，张建凯，程光，张树波，高晓增，刘铁军，张小平
(华北理工大学附属医院，河北唐山063000)

摘要:目的观察饥饿对大鼠大脑皮质微管相关蛋白1轻链3( LC3)、Beclin 1自噬相关蛋白表达的影响。方法将70只SD大鼠随机分为3组，对照组10只、短期组30只(饥饿1、2、3 d各10只)、长期组30只(饥饿5、7、9 d各10只)。对照组正常饮食，短期组和长期组均采取全饥饿处理。对照组于饥饿起点、短期组与长期组分别于相应饥饿终点断头取脑，采用Western blot法检测大脑皮质的LC3与Beclin 1。结果短期组饥饿3 d大脑皮质LC3 与Beclin 1较对照组表达上调( P＜0.05、0.01)，长期组较对照组及短期组大脑皮质LC3与Beclin 1表达上调( P均＜0.01)。短期组饥饿1 d与2 d时大脑皮质LC3、Beclin 1表达比较，P均＞0.05;长期组饥饿7 d与9 d时大脑皮质Beclin 1表达比较，P＞0.05。结论短期饥饿2 d内大鼠大脑皮质LC3、Beclin 1表达未发生明显改变，随饥饿时间延长，大鼠大脑皮质LC3与Beclin 1表达上调。

关键词:自噬;饥饿;大脑皮质;微管相关蛋白1轻链3;自噬相关蛋白

自噬是细胞内的物质成分利用溶酶体被降解过程的统称，自噬体形成是其过程中一重要阶段［1］。微管相关蛋白1轻链3( LC3)是自噬体膜上的标记蛋白［2］，Beclin 1在自噬体形成过程中发挥重要调控作用［3］，二者的表达变化可在某种程度上反映自噬的激活。体外细胞实验表明，营养缺乏是自噬发生的激活剂［4，5］。机体对饥饿状态代谢反应的整体调节是复杂变化的，自噬本身也是一个随时间动态变化的过程。脑作为神经中枢，其对饥饿引起的应激反应具有特殊性。2013年9月～2014年12月，我们观察了饥饿对大鼠大脑皮质自噬相关蛋白LC3、Beclin 1表达的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料3月龄健康雄性SPF级SD大鼠70只，体质量330～370 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心［许可证号: SCXK-(军) 2009-003］。于室温20～24℃、相对湿度45%～55%、通风良好、12 h昼夜节律、氨浓度＜14 mg/m3条件下，用标准鼠饲料适应性喂养1周。兔抗大鼠LC3多克隆抗体( MBL公司，日本)，兔抗大鼠Beclin 1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，SP-9001免疫组化检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司) ; BX61金相研究级正立显微镜( Olympus公司，日本)，蛋白电泳仪、湿电转膜仪( Bio-RAD公司，美国)。

1.2动物分组与处理将70只大鼠单笼饲养1周，以体质量作为分层因素随机分为对照组10只、短期组30只(饥饿1、2、3 d各10只)和长期组30 只(饥饿5、7、9 d各10只)。对照组正常饮食，短期组和长期组采取全饥饿处理(无饲料供应，自由饮水)。以饥饿开始当日上午8时作为饥饿起点，以饥饿时间达相应时点的上午8时作为饥饿终点。对照组于饥饿起点、短期组与长期组于相应饥饿终点，腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，断头取脑，迅速分离出大脑皮质，－80℃冰箱保存备用。

1.3大鼠大脑皮质LC3、Beclin 1表达检测采用Western blot法。取低温冻存的脑组织，切碎后置于玻璃匀浆器中。根据组织净重，按1∶10加入相应体积预冷的裂解液;冰浴研磨匀浆，静置至充分裂解; 4℃12 000 r/min离心20 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。向蛋白样品中加入5×上样缓冲液，沸水中变性5 min。每孔总蛋白上样50 μg，行SDSPAGE凝胶电泳;将蛋白湿转至PVDF膜，TBST洗膜10 min×3次; 5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h后，加入兔抗大鼠LC3一抗( 1∶1 000)、兔抗大鼠Beclin 1一

抗( 1∶500)，以β-actin作为内参，4℃孵育过夜。TBST洗膜10 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗( 1∶5 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜20 min×3次。向膜上滴加ECL化学发光试剂并使之与膜充分接触1 min，暗室曝光、显影、定影，图像扫描。采用Image J软件对条带进行分析，以目的蛋白条带与内参条带灰度比值作为LC3、Beclin 1相对表达量。

1.4统计学方法采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用双向分类的方差分析，多重比较选用Dunnett-t检验与LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

三组大脑皮质LC3、Beclin 1蛋白相对表达量比较，见表1。

表1　三组大脑皮质LC3、Beclin 1蛋白相对表达量比较(±s)

表1　三组大脑皮质LC3、Beclin 1蛋白相对表达量比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01;与短期组比较，ΔP＜0.01。

组别　n LC3　Beclin 1短期组饥饿1 d　 5　0.20±0.03　0.22±0.03饥饿2 d　 5　0.22±0.04　0.23±0.04饥饿3 d　 5　0.36±0.06*　0.40±0.06#长期组饥饿5 d　 5　0.80±0.08#Δ　0.65±0.08#Δ饥饿7 d　 5　1.41±0.08#Δ　1.11±0.10#Δ饥饿9 d　 5　1.63±0.09#Δ　1.05±0.11#Δ对照组5　0.19±0.03　0.20±0.03

3　讨论

生理状态下，细胞自噬保持在一个较低的水平，主要用于清除衰老或损伤的细胞器和蛋白质的转化。在营养缺乏、缺氧、蛋白质错误折叠及胞内病原菌感染等应激情况下，自噬增强。饥饿条件下，自噬可降解胞内物质，产生代谢中间产物以满足细胞需求，维持细胞稳态［8］。

自噬过程由一系列自噬相关基因( Atg)编码的对应蛋白参与完成，LC3是酵母Atg8在哺乳动物中的同源物，细胞内LC3蛋白的存在形式主要有LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ两种。LC3-Ⅰ散在分布于细胞质内，在自噬体形成阶段，LC3-Ⅰ与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ; LC3-Ⅱ稳定地定位在自噬体的内外膜上，直到自噬体与溶酶体融合后，被溶酶体水解酶降解［9］。在Western blot检测中，LC3-Ⅱ与抗体的结合能力强于LC3-Ⅰ，即LC3-Ⅱ的检测敏感性高于LC3-Ⅰ［10］。本研究结果显示，短期组饥饿1、2 d者较对照组大脑皮质LC3表达差异无统计学意义，表明短期饥饿处理2 d内大脑皮质自噬体数量未发生明显变化。Mizushima等［11］研究显示，饥饿诱导24、48 h，在小鼠的肝脏等大部分组织器官中可观察到自噬的激活，但在大脑、小脑中未观察到自噬水平的升高。本研究结果与之一致，提示饥饿对自噬的诱导效应存在组织器官特异性。此外，饥饿初期，在机体代谢的整体调节下，肝糖原分解增加，且肝细胞发生自噬，降解细胞内的蛋白质;肝糖异生增加在一定程度上维持了脑组织的能量供应［12］，致使脑组织中对营养和能量缺乏敏感的mTORC1与AMPK等自噬通路［13～15］的相关调控信号水平未发生明显改变。本研究进一步观察结果显示，长期组较对照组及短期组LC3表达上调。表明随着饥饿时间的延长，自噬体水平增高。然而，长期饥饿状态下大鼠大脑皮质自噬体数量显著增多，可能与自噬体生成的增多和(或)自噬体降解减少有关。

Beclin 1是酵母Atg6基因在哺乳动物中的同源物［16］。Beclin 1蛋白可通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶( Vps34)形成复合物参与自噬，且Beclin 1/Vps34复合物可作为一种招募平台使其他Atg蛋白定位于前自噬体而促进自噬体的形成。内源性的Beclin 1定位于反面高尔基网、线粒体、核周膜和内质网［17］。研究表明，Beclin 1具有Bcl-2结合结构域、BH3结构域和细胞核输出信号( NES)等5个结构域［18］。其中，Bcl-2与Beclin 1相互作用并干扰Vps34和Beclin 1形成复合物;而NES可将Beclin 1从细胞核运送到胞质中，并以这种胞质形式调节自噬［19］。本研究结果显示，短期组饥饿1、2 d较对照组Beclin 1表达差异无统计学意义，饥饿3 d表达上调，长期组较对照组及短期组Beclin 1表达上调。饥饿条件下Bcl-2在内质网中发生磷酸化，导致Bcl-2与Beclin 1之间的相互作用下降［20］，也可刺激自噬。须注意的是，本研究长期组饥饿9 d与饥饿7 d比较，Beclin 1表达差异无统计学意义，但LC3表达差异有统计学意义。提示长期饥饿状态下，自噬功能发生紊乱，如长期的营养与能量缺乏可造成溶酶体、线粒体等细胞器结构和功能的破坏，进而导致自噬溶酶体降解能力下降，使自噬体出现蓄积。

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收稿日期:( 2015-03-27)

通信作者:张小平

文章编号:1002-266X( 2015)30-0023-03

文献标志码:A

中图分类号:R363

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.008