UPLC-Q-TOF/MS法鉴定兽药磺胺二甲嘧啶在小鼠血液和尿液中的代谢产物

孙汉文，孟哲, 2,石志红,吕运开

(1.河北大学化学与环境科学学院,河北省分析科学技术重点实验室,河北保定　071002；

2.宁夏大学能源化工重点实验室,宁夏银川　753200)

UPLC-Q-TOF/MS法鉴定兽药磺胺二甲嘧啶在小鼠血液和尿液中的代谢产物

孙汉文1，孟哲1, 2,石志红1,吕运开1

(1.河北大学化学与环境科学学院,河北省分析科学技术重点实验室,河北保定071002；

2.宁夏大学能源化工重点实验室,宁夏银川753200)

摘要：采用UPLC-Q-TOF/MS联用技术鉴定了兽药磺胺二甲嘧啶在小鼠血浆和尿液样品中的代谢产物.并运用Q-TOF质谱仪进行MS和MS/MS精确质量数的测定，得到磺胺二甲嘧啶和各个代谢产物的准确分子质量和化学组成.依据精确质量数据，结合Metabolynx XS辅助软件鉴定兽药磺胺二甲嘧啶在ESI源正离子模式下的代谢产物.研究结果表明，磺胺二甲嘧啶在小鼠的血样和尿样中主要的目标代谢途径为乙酰化反应，非目标代谢途径主要为甲基化和结合反应.

关键词：兽药；磺胺二甲嘧啶；UPLC-Q-TOF/MS；代谢产物

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.005

中图分类号：O65

文献标志码：志码：A

文章编号：编号：1000-1565(2015)02-0131-07

收稿日期:2014-10-15

基金项目：河北省应用基础研究计划重点基础研究项目(10967126D)

Abstract:In the present study, the metabolic profile of sulfamethazine in vivo, a veterinary drug, was investigated using ultra-performance liquid chromatography coupled to high resolution quadrupole time-of-flight mass spectrometry to acquire structural information on sulfamethazine metabolites. The corresponding product ion spectra were acquired and interpreted, and structures were proposed. Accurate mass measurement using ESI-Q-TOF/MS was using to determine the elemental composition of metabolites, thereby confirming the proposed structures of these metabolites. This study demonstrated that acetylating metabolic reaction was predominantly observed in mice plasma and urine, including target metabolite N4-Acetylsulfamethazine, subcardinal metabolites come from methylating renction and conjugates reaction.

Identification of metabolites of veterinary drug sulfamethazine in mice

plasma and urine using ultra performance liquid chromatography

coupled to high resolution quadrupole time-of-flight mass spectrometry

SUN Hanwen1, MENG Zhe1,2, SHI Zhihong1, LÜ Yunkai1

(1. Key Laboratory of Analytical Science and Technology of Hebei Province,

College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding 071002, China;

2.Key Laboratory of Energy Chemical Engineering, Ningxia University, Yinchuan 753200, China)

第一作者：孙汉文(1945- )，男，河北魏县人，河北大学教授，博士生导师，主要从事光学分析、分离科学技术、环境分析化学和农兽药残留分析研究.E-mail： hanwen@hbu.edu.cn

Key words: veterinary drug; sulfamethazine; UPLC-Q-TOF/MS; metabolite

磺胺类药物是一类人工合成抗菌药，广泛应用于预防和治疗细菌感染性疾病，其中磺胺二甲嘧啶与其他磺胺类药物一样，可用作饲料添加剂，以提高奶牛、生猪的抗病能力，提高饲料的转化率和促进动物的生长发育[1].兽药残留是动物用药普遍存在的问题，而磺胺二甲嘧啶又是所有磺胺中残留超标的主要药物.许多国家和国际组织制定了磺胺类药物总和的最大允许残留限<0.1 mg/kg[2-3].中国和日本等国家规定牛奶中磺胺二甲嘧啶不得超过0.025 mg/kg和0.01 mg/kg[3].兽药的使用无疑会导致原形药物、代谢产物或杂质在动物细胞、组织和器官内以及可食性动物产品中滞留和蓄积[4].磺胺类药物的主要代谢物为乙酰化磺胺，在尿中溶解度低，易在肾小管中结晶，导致对肾脏的损害[5].

体内各组织器官中药物代谢产物的分析研究，往往会受到生物样品中内源性物质如脂质、类固醇、胆红素、糖类和蛋白质等成分的干扰，往往要求在复杂生物样品基质中进行痕量药物分析.传统代谢物表征实验使用液相色谱-放射性流动检验[6]和最新开发的放射性色谱与质谱法结合用于表征代谢物的技术[7]，均受获得放射性标记物的制约.随着现代质谱技术的快速发展，高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)已经成为检测和鉴定代谢物首选的分析工具.采用三重四极杆串联质谱进行产物离子扫描、中性丢失扫描和前体离子扫描是进行目标代谢产物筛查的常用手段，而采用离子阱质谱进行多级质谱分析(MSn)更是确认目标代谢物结构解析的有力工具[8-9].然而，新型质谱技术的出现，飞行时间(time-of-flight，TOF)质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)等，可以获得准分子离子和碎片离子的精确分子质量和分子组成，更有助于鉴定生物基质中可预测代谢途径或不可预测代谢途径产生的代谢物，并且大大缩短了鉴定药物代谢物的研究时间.

目前，在缺少对照品情况下，超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)联用技术结合代谢物寻找软件MetaboLynxTM已经用于药物代谢产物的鉴定[10-12].通过对含药样品与空白样品的比对分析，去除所有干扰离子而简化质谱图，从而能从复杂生物基质中快速检测药物代谢产物.但用于动物性食品中残留兽药代谢产物的研究尚未见报道.

本实验通过收集小鼠灌胃给予磺胺二甲嘧啶兽药后的血浆和尿液样品，利用UPLC-Q-TOF/MS联用技术，结合Masslynx Metabolynx XS辅助软件，将Q-TOF/MS测定的准确质量用于鉴定和确认磺胺二甲嘧啶兽药在动物体液中的代谢物.通过对磺胺二甲嘧啶兽药在动物体液中代谢产物的研究，为更好地认识动物源性食品中兽药及其代谢物的残留提供科学的依据.

1实验部分

1.1　实验动物与样品处理方法

1.1.1动物实验方法

随机选择健康 ICR小鼠6只，8周龄，雌雄各半，体质量(28±5)g.其中1对雌雄作为空白，另外2对雌雄进行平行实验.

给药方案：健康小鼠实验前禁食5 h，自由饮水.灌胃给磺胺二甲嘧啶0.5%(质量分数)的KCl生理盐水混悬液(相当于30 mg/kg).给药后继续禁食5 h，自由饮水.每天早晚灌胃给药各1次，每次1 mL，连续灌胃4 d.停药后，收集ICR小鼠新鲜尿样，于-20 ℃保存.停药后，禁食8 h后眼眶取血，置含有肝素的试管，6 ℃离心(6 000 r/min，15 min)，取上层血浆，于-20 ℃保存.

1.1.2样品的处理方法

准确移取体液样品(200 μL)于10 mL离心管，加入1 mL酸性甲醇(pH 4.0)，涡旋混均1 min，静止10 min，6 ℃离心(11 000 r/min，15 min)，将提取液转移至已用3 mL甲醇和3 mL水活化的Oasis HLB固相萃取小柱(3 mL, 60 mg)，待淋洗液流干后，以3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50 ℃下氮吹至近干，以甲醇-水(体积比50∶50)溶解， 0.22 μm微孔滤膜过虑，转移至自动进样瓶，待UPLC-Q-TOF/MS分析.

1.2　仪器与试剂

超高液相色谱仪(ACQUITY UPLC®Ultra Performance LC，美国waters公司)；四极杆/飞行时间质谱仪(SYNAPT G2TMHDMS，美国waters公司)；MassLynxTM4.1软件用于数据采集及处理；Acquity UPLCTMBEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国 waters公司)；TGL-16M高速冷冻离心机(湘仪)；MX-F涡流混合器(2 500 r/min, 美国 SCILOGEX，LLC公司)；SZ-97自动三重水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；Oasis HLB 固相萃取柱(3 mL, 60 mg, 美国waters公司)；0.22 μm尼龙膜(美国 Waters公司)

磺胺二甲嘧啶及其代谢物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶购自加拿大TRC公司，纯度均大于98%(质量分数).甲醇、乙腈和甲酸(色谱纯，迪马公司)；正己烷(分析纯).

标准混合溶液包括10 μg/L的磺胺二甲嘧啶和200 μg/L的代谢物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶.

1.3　UPLC色谱条件

Acquity UPLCTMBEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)；柱温40 ℃；进样量5 μL；流动相(A)是体积分数0.1%甲酸的水溶液；流动相(B)是体积分数0.1%甲酸的甲醇溶液.梯度洗脱条件见表1.

表1　流动相梯度洗脱程序

1.4　四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF/MS)条件

最佳的Q-TOF/MS质谱条件:电喷雾离子源(ESI)：正离子模式ESI+，毛细管电压3 kV，锥孔电压35 V；萃取锥孔电压4 V；脱溶剂气温度350 ℃；离子源温度110 ℃；脱溶剂气流速650 L/h；锥孔气流速50 L/h；四极杆采集质量数30～800 u.数据采集模式：棒状；参比溶液：2 μg/L亮氨酸脑啡肽(LE)；采集时间0.5 s；采集间隔时间10 s；扫描精确质量数556.2771(ESI+).分辨率>20 000 FWHM.

1.5　代谢产物的鉴定与分析

将磺胺二甲嘧啶可能的Ⅰ相代谢途径如：还原、氧化、羟化等和可能的Ⅱ相代谢途径如: 甲基化、乙酰化、磺酸化、葡糖醛酸化、磺酸化葡糖醛酸化等输入MetaboLynx软件Metabolite List窗口，同时定义质量缺陷过滤(mass defect filtering，MDF)窗口为50 mu，软件自动根据采集的数据及设置的处理方法进行分析.通过MDF应用程序后，大部分内源性干扰离子会被除去，经过滤的数据有利于对药物代谢物离子的鉴定.

2结果与讨论

2.1　UPLC-Q-TOF-MS条件的优化

传统的代谢物表征实验，常采用反相液相色谱、缓慢的梯度洗脱以及长色谱柱，来确保生物基质中极性大于母药的代谢物的保留及获得足够的分离.实验选用Acquity UPLCTMBEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，waters)，由于UPLC优越的色谱分辨率和峰容量，大大减少了共洗脱成分的数目[10-12].磺胺类药物含有易于和H+结合的带有孤对电子的N或O原子，选择ESI(+)作为电离模式，以酸性体系为流动相，分别考察了体积分数0.1 %甲酸-甲醇和体积分数0.1%甲酸-乙腈流动相对磺胺二甲嘧啶及目标代谢物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶的分离、离子化效率和峰形的影响.与乙腈相比，采用甲醇作为流动相时，更有利于极性更大的代谢物的保留.如图1给出了在ESI+模式下，50 μg/L磺胺二甲嘧啶及其目标代谢物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶基质匹配标准混合液的总离子流色谱图(total ion chromatograms，TIC)及提取离子色谱图(extraction ion chromatograms，EIC).

图1　在ESI+模式下，磺胺二甲嘧啶及其目标代谢物的总离子流色谱及提取离子色谱　Fig.1　TIC and EIC of sulfamethazine and its target metabolite under positive ion mode

2.2　磺胺二甲嘧啶原型药物裂解规律解析

由于代谢物的质谱图中通常含有一些和母体化合物相关的离子碎片，因此首先阐明原型兽药磺胺二甲嘧啶在ESI源正离子模式下的裂解规律，为代谢物的结构鉴定提供依据.

在最佳的色谱-质谱条件下，增加源内碰撞诱导解离能量(collision-induced dissociation，CID)至25 V，获得磺胺二甲嘧啶的质谱图如图2.采用ESI-Q-TOF/MSE质谱扫描，在低能量区原兽药准分子离子峰[M+H]+对应的准确分子质量为m/z279.092 4，相应的化学式组成为C12H14N4O2S，质量误差为0.6 mu.在高能量区其相应的二级碎片离子主要有m/z213，204，186，156，124和108，同时也显示了少量的[M+Na]+(m/z301)离子峰.通过ESI-Q-TOF/MS测定了磺胺二甲嘧啶的准分子离子峰和相应碎片的准确相对分子质量，并且通过准确相对分子质量数得到了各个碎片的化学式组成和化学不饱和度(DBE)，结果列于表2.通过相应碎片离子的数据，给出了磺胺二甲嘧啶在正离子模式下的裂解途径，结果见图3.这些离子作为诊断离子用于鉴定磺胺二甲嘧啶的代谢物的结构.

图2　在ESI+模式下，源内碰撞诱导解离能量至25 V时获得磺胺二甲嘧啶的MS/MS　Fig.2　MS/MS spectra of sulfamethazine under positive ion mode and proposed CID 25 V

表2　磺胺二甲嘧啶及其碎片离子的质谱信息

图3　在正离子模式下，磺胺二甲嘧啶裂解机理　Fig.3　Fragment pathway of sulfamethazine under positive ion mode

采用Metabolynx软件将UPLC-Q-TOF/MSE采集的MS数据和MS/MS数据进行处理，该软件以MDF处理为基础，用于复杂生物基质中快速检测药物代谢物[10-11].通过与空白样品比较，在给药后小鼠的血浆样品和尿液样品中均发现了原型兽药磺胺二甲嘧啶、目标代谢物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶和多个非目标代谢产物，相应的主要代谢物的提取离子流色谱图和原兽药及目标代谢物的提取离子色谱见图4.通过综合分析每种代谢产物的保留行为、准分子离子和碎片离子，推测出磺胺二甲嘧啶在小鼠的血样和尿样中的代谢产物.所检测到的母体磺胺二甲嘧啶及其在体液血浆和尿液中代谢产物的相关信息见表3.

根据所得原型兽药磺胺二甲嘧啶、目标代谢物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶和多个非目标代谢产物的多个离子碎片信息(包括精确分子质量和元素组成)，以表2给出的磺胺二甲嘧啶特征碎片离子作为诊断离子来推测磺胺二甲嘧啶在动物血样和尿样中代谢物的结构.

2.3.1原型兽药M0的鉴定

通过单独分析磺胺二甲嘧啶基质匹配标准品(图1)，其母体药物的保留时间是5.59 min，因此可以确认在血样和尿样中保留时间为5.59 min，且m/z279的峰是未被代谢的母体药物.然而，在给药之后的小鼠尿液m/z279的通道中在保留时间为5.61 min出现了另外一个色谱峰，Q-TOF质谱测定可知其精确分子质量为279.093 6(2.0 mu)，相应的化学式C12H14N4O2S，这与磺胺二甲嘧啶的质谱信息完全一样.在分析尿样中代谢物M4时，发现在代谢物M4的提取通道中同时共存保留时间为5.61 min且m/z279的峰，因此此峰被推断为II相结合代谢物M4的源内裂解造成的.

图4　磺胺二甲嘧啶在小鼠血浆和尿液样品中主要代谢产物的色谱图和原兽药磺胺二甲嘧啶及目标代谢物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶的提取离子色谱　Fig.4　Metabolites profile of sulfamethazine in mice plasma and urine, and extraction ion chromatogram of sulfamethazine and its target metabolite N4-acltysulfamethazine.

兽药样品代谢物反应化学式精确分子质量(m/z)误差mu保留时间/min备注磺胺二甲嘧啶C12H14N4O2Sm/z279.0916血浆血浆M1→去甲基化C11H12N4O2S265.07691.04.81非目标MN→乙酰化C14H16N4O3S321.1010-1.15.86目标MN→乙酰化C14H16N4O3S321.1004-1.75.99目标M2→去甲基化+2×羟化-HNC11H11N3O4S282.0537-1.16.35非目标M3→2×羟化C12H14N4O4S311.0809-0.57.28非目标尿液M1→去甲基化-NNC11H16N2O5257.1127-1.01.66非目标M2→醇脱水-HNC12H11N3OS246.07474.64.52非目标M3→3×羟基化-HNC12H13N3O5S312.06620.85.62非目标MN→乙酰化C14H16N4O3S321.10270.65.82目标MN→乙酰化C14H16N4O3S321.1018-0.36.01目标M4→谷胱甘肽结合物-C6H7N3C16H22N4O7S2447.0917-9.16.67非目标

2.3.2目标代谢物MN的鉴定

通过分析目标代谢物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶基质匹配标准品(图1)，其保留时间是5.99 min，因此可以确认在血样和尿样中保留时间为5.9 min，且m/z321的峰是磺胺二甲嘧啶乙酰化代谢产物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶.但是，在给药之后的小鼠血样和尿液m/z321的通道中同时出现保留时间为5.8 min的另外一个色谱峰，Q-TOF质谱测定可知其精确分子质量为321.102 7 (0.6 mu)，相应的化学式C14H16N4O3S，这与N4-乙酰磺胺二甲嘧啶的质谱信息完全一样.实验表明，N4-乙酰磺胺二甲嘧啶在体内代谢存在异构体现象.

2.3.3非目标代谢产物的鉴定

在血样和尿样中发现了一类羟基化代谢物，如血样中M2m/z282和M3m/z311，尿样中M3m/z312，其二级质谱中均显示磺胺二甲嘧啶的主要碎片m/z108，124和156.表明这类代谢物多为磺胺二甲嘧啶母体的羟基化代谢产物.相对于血样的代谢物，尿样中的代谢物更复杂，代谢物M4在给药后小鼠的尿液中被发现.代谢物M4的[M+H]+为m/z447，保留时间为6.67 min.在M4的二级质谱中发现特征中性丢失308 u(谷胱甘肽)和母体的特征碎片m/z156和124，因此判断M4为母体碎片的谷胱甘肽结合物.

3结论

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS联用技术，运用Q-TOF质谱仪进行MS和MS/MS精确质量数的测定，得到相应碎片离子的分子式.依据精确质量数据，结合Metabolynx XS辅助软件筛选出兽药磺胺二甲嘧啶在小鼠血样和尿样的代谢产物.在血浆样品中发现3个I相代谢物和1个II相代谢物；在尿液样品中发现3个I相代谢物和2个II相代谢物.每个代谢物中至少含有2个碎片离子与母药的碎片离子的信息相同，同时磺胺二甲嘧啶在体内代谢生成的目标乙酰代谢物存在异构现象.通过对雌性小鼠和雄性小鼠血样和尿样中代谢产物的对比分析，没有显出差别.

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(责任编辑：梁俊红)