HPLC法测定窝儿七中5种成分的含量

赖菁华，宋小妹

(1.陕西能源职业技术学院医学技术系，西安　710613；2.陕西中医药大学，咸阳　712046)



HPLC法测定窝儿七中5种成分的含量

赖菁华1，宋小妹2*

(1.陕西能源职业技术学院医学技术系，西安710613；2.陕西中医药大学，咸阳712046)

摘要：目的建立HPLC测定窝儿七中5种成分含量的方法。方法色谱柱为Cosmosil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温25 ℃；甲醇-4 mL·L-1磷酸溶液梯度洗脱；流速1 mL·min-1；检测波长300 nm。结果4′-去甲基鬼臼毒素(1)、鬼臼毒素(2)、槲皮素(3)、山柰酚(4)和山荷叶素(5)的线性范围分别为4.5～224.0 (r=0.999 2)，20.0～1 000.0 (r=0.999 4)，1.6～78.0(r=0.999 3)，4.2～210.0(r=0.999 7)和102.2～256.2(r=0.999 4)，平均回收率分别为 99.8%(RSD=1.4%)，99.8%(RSD=1.7%)，99.8%(RSD=1.5%)，99.9%(RSD=2.3%)和98.1%(RSD=1.7%)。结论该方法灵敏、准确、重复性好，为窝儿七的质量控制提供参考依据。

关键词：窝儿七；含量测定；高效液相色谱法

窝儿七又名窝儿参、阿儿七，为小檗科山荷叶属植物中华山荷叶(DiphylleiasinensisLi.)的干燥根及根茎，产于陕西眉县、太白县、户县等，是陕西秦巴特色资源太白七药之一，具有祛风除湿、活血止痛、镇咳平喘等功效，主治腰腿疼痛、风湿性关节炎、跌打损伤、月经不调等[1-4]。现代研究表明，窝儿七主要化学成分为鬼臼毒素、脱氢鬼臼毒素、山荷叶素、异苦鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、山柰酚、槲皮素等。药理研究表明，鬼臼毒素具有抗肿瘤作用，黄酮类成分在心血管系统、内分泌系统和抗肿瘤方面具有明显的作用，从而引起人们的广泛关注[5-6]。目前已有文献报道采用HPLC法测定窝儿七中鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚的含量[7]，但未见同时测定窝儿七药材中4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚、山荷叶素含量的报道。本研究在窝儿七化学成分分离的基础上，采用HPLC法同时测定窝儿七中5种主要化学成分的含量。该方法灵敏、准确、重复性好，可为制订窝儿七质量标准提供参考依据。

1仪器与试药

1.1仪器Waters 2695/2996分析型高效液相色谱仪(Empower工作站，美国Waters公司)；BP210S电子天平(德国Sartorius公司)；基因型18100摩尔超纯水机(重庆摩尔水处理设备有限公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山超声波仪器有限公司)

1.2试药窝儿七药材采自陕西秦岭太白山，由陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为小檗科山荷叶属植物中华山荷叶(DiphylleiasinensisLi.)的干燥根及根茎；4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚、山荷叶素对照品均为实验室自制，面积归一化法计算含量，质量分数均达到98%以上。

2方法与结果

2.1色谱条件Cosmosil-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为以甲醇(A)-4 mL·L-1的磷酸水溶液(B)梯度洗脱(流动相A 0～5 min，92%～95%；5～25 min，95%～45%；25～70 min，45%～80%；70～100 min，80%)，流速为1 mL·min-1；检测波长为300 nm；进样量为10 μL。

2.2对照品溶液的制备 取4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚和山荷叶素对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为2.24，10.00，0.78，2.10和5.12 mg·mL-1的溶液，作为混合对照品溶液，备用。

2.3供试品溶液的制备取窝儿七药材粉末(过4号筛)约0.50 g，精密称定，加入20 mL甲醇超声(220 W，40 kHz，25 ℃)提取2次，每次30 min，滤过，滤液合并，水浴蒸干，残渣用甲醇定容至25 mL量瓶中，作为供试品溶液，备用。

2.4线性关系考察取2.2项下混合对照品溶液，用甲醇分别稀释0，1.2，2.5， 3.5，5.0，10.0和50.0倍，配制成系列质量浓度的混合对照品溶液，分别进样10 μL。以进样量X对色谱峰面积Y绘制标准曲线，得5种化合物的回归方程，结果表明，5种化合物的线性关系良好。见表1。

表15种化合物的标准曲线

Tab.1 Standard curves of the five constitutes

化合物回归方程r线性范围/μg·mL-14'-去甲基鬼臼毒素Y=3×106X-6765.50.99924.5～224.0鬼臼毒素Y=3.6×106X-64290.999420.0～1000.0槲皮素Y=5.9×106X-182880.99931.6～78.0山柰酚Y=1.7×107X-268080.99974.2～210.0山荷叶素Y=6.1×106X-184890.999310.2～512.4

2.5精密度实验精密吸取窝儿七供试品溶液10 μL，连续进样6次，测得峰面积，计算5种化合物的RSD(n=6)分别为1.93%，0.83%，2.82%，1.82%和1.59%。结果表明，仪器精密度良好。

2.6稳定性实验精密吸取窝儿七供试品溶液10 μL，分别在0，2，4，8，12和24 h进行测定，记录峰面积，结果5种化合物峰面积的RSD(n=6)分别为1.82%，0.86%，2.71%，1.51%和1.48%。结果表明，供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7重复性实验称取窝儿七药材粉末6份，按照2.3项下的方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定峰面积，结果5种化合物峰面积的RSD(n=6)分别为1.72%，0.89%，2.64%，1.61%和1.61%。结果表明，该方法的重复性良好。

图1HPLC图

A.空白溶液；B.混合对照品溶液；C.供试品溶液；1.4′-去甲基鬼臼毒素；2.鬼臼毒素；3.槲皮素；4.山柰酚；5.山荷叶素

Fig.1 HPLC chromatograms

A.blank solution；B.mixed standard substances；C.test samples；1.4′-demethylpodophyllotoxin；2.podophyllotoxin；3.quercetin；4.kaempferol；5.diphyllin

2.8加样回收率实验取已知含量的窝儿七药材粉末约0.25 g，共6份，精密称定，每份分别加入一定量的对照品，置于锥形瓶中并加入20 mL甲醇超声(220 W，40 kHz，25 ℃)提取2次，每次30 min，滤过，合并滤液，水浴蒸干，残渣用甲醇定容至25 mL，得供试品溶液。按照2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率。结果显示，5种化合物平均回收率分别为99.8%，99.8%，99.8%，99.9%和98.1%，RSD(n=6)分别为1.4%，1.7%，1.5%，2.3%和1.7%。结果见表2。

表2加样回收率实验结果

Tab.2 Results of the recovery test

(n=6)

2.9样品测定取3批次窝儿七药材粉末各3份(过4号筛，低温烘干至恒质量)，每份约0.50 g，精密称定，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下的色谱条件测定峰面积，计算3批药材中4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚、山荷叶素的含量，结果见表3。

表3窝儿七样品含量测定结果

Tab.3 Results of determination

化合物3个批号样品含量/%201405212014072220140820平均含量/%4'-去甲基鬼臼毒素0.650.650.620.64鬼臼毒素3.813.823.753.79槲皮素0.190.200.180.19山柰酚0.630.650.650.64山荷叶素1.381.361.341.36

3讨论

3.1研究意义窝儿七是陕西太白七药之一，其质量标准的制订尚未开展，严重制约了其使用与开发。本课题组在窝儿七化学成分系统分离的基础上，以其含量较高的主要化学成分为指标，建立快速、准确的含量测定方法，为窝儿七质量标准的建立提供了依据。

3.2样品溶液制备方法的选择黄酮和木脂素类[9-10]化合物极性较小，因此本次实验主要考察甲醇、乙醇和水等溶剂回流提取、超声提取和浸提等不同提取方法对实验结果的影响。结果发现，甲醇超声(500 W，50 Hz，25 ℃)2次，每次30 min，能够将药材中5种主要成分提取完全，而且方法简便，节省时间，重复性好，故确定用甲醇作为提取溶剂。

3.3色谱条件的选择及优化本次实验主测成分为极性较小的木脂素和黄酮类化合物，利用反相高效液相色谱法分离效果不是很好，为了探索一个良好的色谱条件，本实验考察甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸水，乙腈-甲酸水，乙腈-磷酸水，甲醇-甲酸水不同比例洗脱，并结合全波长扫描，结果显示，在2.1项下的色谱条件下化合物分离度大于1.5，且峰形对称，无拖尾等现象。

参考文献：

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Determination of 5 main constituents in Diphylleia sinensis Li. by HPLC

LAI Jinghua1，SONG Xiaomei2*(1. The Department of Medical Technology of Shaanxi Energy Institute，Xi′an 710613，China; 2. Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a quantitative standard of Diphylleia sinensis Li. . Methods The chromatographic separation was performed on a Cosmosil-C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)；the column temperature was 25 ℃.A linear elution of 4 mL·L-1phosphoric acid aqueous solution-methanol was adopted at a flow rate of 1 mL·min-1.The UV detection wavelength was 300 nm.Results4′-Demethylpodophyllotoxin(1)，podophyllotoxin (2)，quercetin(3)，kaempferol (4)，diphyllin (5) showed good linearity in the range of 4.5-224.0(r=0.999 2)，20.0-1 000.0(r=0.999 4)，1.6-78.0(r=0.999 3)，4.2-210.0 (r=0.999 7) and 102.2-256.2(r=0.999 4)，and the average recoveries were 99.8% (RSD=1.4%)，99.8% (RSD=1.7%)，99.8% (RSD=1.5%)，99.9% (RSD=2.3%) and 98.1% (RSD=1.70%)，respectively. ConclusionThe method is sensitive，accurate and reproducible. It can be used for the determination of main constituents in Diphylleia sinensis Li. .

Key words:Diphylleia sinensis Li.；determination；HPLC

收稿日期：(2015-04-24)

通信作者：*宋小妹，女，博士，教授

作者简介：赖菁华，女，讲师

基金项目：陕西省中医管理局科研项目(编号：zy09)

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)01-0012-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.004