钙蛋白酶活化在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用



钙蛋白酶活化在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用

张双1，2，徐磊2，岳荣川2，张辉1，王欢2，陈海燕2，谭春燕2，张荣驿2，倪海燕1

(1.什邡市人民医院心内科，四川什邡618400; 2.川北医学院附属医院心内科，四川南充637000)

【摘要】目的:探讨钙蛋白酶在小鼠心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)损伤中的作用。方法:采用结扎/松解左冠状动脉前降支的方法建立小鼠心肌I/R模型。将实验动物随机分为假手术组、I/R组(冠状动脉结扎45 min，再灌注3 h)及PD + I/R组(I/R前30 min静脉注射钙蛋白酶抑制剂-PD150606 1 mg/kg)。再灌注结束后，测定各组心肌梗死面积、细胞色素C含量、caspase-3活性。结果:与I/R组相比，PD150606预处理组心肌梗死区域面积明显减小，且PD150606能明显抑制由I/R引起的细胞色素C含量及caspase-3活性增加。结论:钙蛋白酶活化介导的心肌细胞凋亡在小鼠心肌I/R损伤中发挥了重要的作用。

【关键词】钙蛋白酶;缺血/再灌注;凋亡

钙蛋白酶是一类钙依赖的非溶酶体半胱氨酸蛋白酶，普遍存在于哺乳动物的细胞内［1-2］。大量研究［3-5］表明，钙蛋白酶参与心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)损伤，抑制钙蛋白酶活性可减轻心肌I/R损伤。然而，钙蛋白酶引起心肌I/R损伤的具体机制仍不清楚。因此，本研究应用钙蛋白酶特异性抑制剂PD150606预处理小鼠I/R模型，观察其对心肌I/R损伤的作用，并进一步探讨其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物分组

C57BL/6小鼠随机分成3组:①假手术组:麻醉开胸后只穿线，不结扎血管;②缺血/再灌注(I/R)组:穿线结扎血管缺血45 min，再灌注3 h;③PD150606预处理(PD + I/R)组:缺血前30 min给予PD150606 1 mg/kg，然后进行I/R处理。

1.2小鼠心肌I/R模型建立

本实验根据之前实验方法采用结扎/松解左冠状动脉前降支(LAD)的方式建立小鼠心肌I/R损伤模型［6］。具体方法描述如下:实验动物术前6 h禁食，自由进水。腹腔注射4％戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉C57BL/6小鼠，去除胸前毛发，将其仰卧固定于鼠台，行气管插管，小动物呼吸机维持通气。在小鼠胸部左侧3～4肋间剪开皮肤，钝性分离肌层，弯镊子撑开胸腔，暴露心脏，撕开心包膜。在显微镜下，用8-0丝线阻断LAD血流造成心肌缺血并关闭胸腔;假手术组只穿线不结扎。缺血45 min后重新打开胸腔，松解结扎线实现缺血后再灌注，按上述方法关闭胸腔并逐层缝合切口。再灌注3 h后取材并进行各项指标的检测。

1.3心肌梗死面积计算

小鼠心肌缺血45 min，再管灌注3 h后，采用的Evens Blue和2、3、5-氯化三苯基四氮唑(Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC)双染色法确定梗死和缺血区域［7-8］。

1.4ELISA测定心肌细胞中细胞色素C含量

根据我们之前实验中的方法，采用双抗体夹心法测定标本中细胞色素C的水平。

1.5测caspase-3的活性

根据文献［9-10］中的方法，用caspase-3荧光检测试剂盒来检测细胞caspase-3活性。

1.6统计学分析

所有数据均以均数±标准误表示，采用Graph-Pad Prism 5.0软件统计分析并作图，多组总体采用one way ANOVA分析，两组间差异比较用Newman-Keuls分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1钙蛋白酶活性对I/R后心肌梗死面积的影响

结扎小鼠冠状动脉45 min，再灌注3 h。如图1、图2所示，PD + I/R组与I/R组相比，梗死区域面积明显减小(P＜0.05)，说明抑制钙蛋白酶活性能减轻I/R损伤。

图1　心肌缺血再灌注后小鼠心脏横切面

图2　小鼠心脏I/R后心肌梗死面积分析

2.2抑制钙蛋白酶活性能减少I/R引起心肌细胞凋亡

为明确抑制钙蛋白酶活性减轻心肌I/R损伤是否与阻断心肌细胞凋亡有关，我们检测了细胞caspase-3的活性及细胞色素C的释放情况。与对照组比较，I/R组小鼠心脏梗死周围区域细胞胞浆细胞色素C水平显著增加(P＜0.01)，经PD150606预处理后细胞胞浆细胞色素C水平与I/R组相比明显降低(P＜0.05，图3); I/R组caspase-3活性明显增加(P＜0.01); PD + I/R组与I/R组相比，caspase-3活性明显降低(P＜0.05，图4)，说明抑制钙蛋白酶活性能阻断心肌细胞凋亡。

图3　各组心肌组织Cyt C释放

图4　各组心肌组织内caspase-3活性

3　讨论

心肌I/R损伤指缺血心肌在恢复血流灌注后引起心肌超微结构、心功能和电生理等方面出现的进一步损伤［11］，其分子机制可能与氧化应激、Ca2 +超载、内皮功能障碍、代谢性酸中毒、ATP合成障碍、炎症反应及免疫激活等有关［12-13］。近年来，钙蛋白酶的作用日益受到关注，研究表明钙蛋白酶的异常激活与多种心脏疾病有关，包括I/R损伤、心肌梗死、梗死后心室重构及心衰等［14-16］。钙蛋白酶主要是以无活性的酶形式定位于胞浆中，并与其内源性抑制剂钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)结合;一旦被激活，钙蛋白酶将水解细胞膜上或胞浆中的底物蛋白［2］，活化的钙蛋白酶可以介导细胞凋亡［17］。

心肌细胞凋亡是心肌I/R损伤的最主要的病理形式。为明确钙蛋白酶在I/R损伤中的作用及其可能的分子机制，本研究选用C57BL/6小鼠，通过结扎/松解冠状动脉前降支的方法建立小鼠I/R模型，观察钙蛋白酶抑制剂PD150606对I/R后心肌梗死面积及心肌细胞凋亡的影响。结果发现钙蛋白酶抑制剂PD150606使I/R后的心肌梗死面积明显减小，而且PD150606能有效的阻断I/R引起的细胞色素C的释放和caspase-3的活化。这些结果表明钙蛋白酶活化在心肌I/R损伤中发挥了重要的作用，其引起小鼠心肌I/R损伤的机制可能与其介导的心肌细胞凋亡有关。但钙蛋白酶通过何种方式介导心肌细胞凋亡还需要进一步的研究。

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Effects of calpain activation in myocardial ischemia/reperfusion injury of mouse

ZHANG Shuang1，2，XU Lei2，YUE Rong-chuan2，ZHANG Hui1，WANG Huan2，CHEN Hai-yan2，TAN Chun-yan2，ZHANG Rong-yi2，NI Hai-yan1

(1.Department of Cardiology，People’s Hospital of Shifang，Shifang 618400; 2.Department of Cardiology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To determine whether and how calpain involved in ischemia/reperfusion(I/R)-injury.Methods: Ligation and release of the left coronary artery was performed to establish mouse myocardial I/R-injury models.Mice were randomly divided into Control group，I/R group and PD + I/R group.Triphenyltetrazolium chloride (TTC)stain was employed to observe the myocardial infarction area in different groups.The level of Cytochrome C and the activity of caspase-3 were also detected.Results: Calpain inhibitor PD150606 significantly reduced the myocardial infarction area caused by I/R.Moreover，we found the level of Cytochrome C and the activity of caspase-3 were significantly increased in I/R group compared with Control group.However，these changes were blunted by PD150606; the increase of Cytochrome C level and caspase-3 activity was inhibited in PD + I/R group.Conclusion: Calpain mediated cardiac myocytes apotosis plays an important role in myocardial I/R-injury of mouse.

【Key words】Calpain; Ischemia/reperfusion; Apotosis

作者简介:张双(1987-)，女，四川彭州人，硕士，住院医师，主要从事心血管疾病方面的研究。E-mail: gcyyzs.136@163.com

基金项目:国家自然科学基金项目(81070101)

收稿日期:2015-02-08

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.02.03

【文章编号】1005-3697(2015)02-0144-03

【中图分类号】R542.2

【文献标志码】A

网络出版时间: 2015-5-1 01∶33网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150501.1333.033.html