miRNA-449b在胃癌组织中的表达及与淋巴结转移的关系

2016-01-11林爱琴,汪根莲,段仁杰等

皖南医学院学报 2015年2期

林爱琴，汪根莲，段仁杰，李铁臣

(皖南医学院分子生物学研究室，安徽芜湖241002)

【摘要】目的：通过对胃癌组织及癌旁组织中miRNA-449b表达的比较，分析miRNA-449b与胃癌发生及淋巴结转移的关系，为进一步探讨其在胃癌中的作用机制提供依据。方法：收集30例胃癌及癌旁组织标本，提取组织总RNA；茎环法反转录成cDNA；用实时荧光定量PCR方法检测miRNA-449b在组织中的表达水平。结果：相比于癌旁组织，miRNA-449b在胃癌组织中有23例(76.67%)表达下调，7例(23.33%)表达上调，其平均表达水平低于癌旁组织，差异有统计学意义(t=2.395，P=0.023，P<0.05)。miRNA-449b在17例有淋巴结转移的样本中16例表达下调(94.12%)，13例无淋巴结转移的样本只有7例表达下调(53.85%)，淋巴结转移组与无淋巴结转移组miRNA-449b的下调比例，经卡方检验，差异有统计学意义(P=0.025，P<0.05)。结论：miRNA-449b与胃癌的发生及淋巴结转移相关。

【关键词】胃癌；miRNA-449b；淋巴结转移

【文献标识码】【中图号】R 735.2A

DOI【】10.3969/j.issn.1002-0217.2015.02.004

文章编号：1002-0217(2015)02-0117-05

基金项目：国家自然科学基金青年

收稿日期：2014-12-08

作者简介：李洋(1981-)，男，讲师，博士，(电话)0551-65167282，15005511566， (电子信箱) tatabox@126.com.

Expression of miRNA-449b in gastric cancer and lymph node metastasisLINAiqin,WANGGenlian,DUANRenjie,LITiechen

Laboratory of Molecular Biology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Abstract【】Objective：To investigate the expression of miRNA-449b in gastric cancer and its adjacent tissue and incidence of lymph node metastasis for elucidating the mechanisms of this gene in development of gastric cancer.Methods: The specimen together with adjacent tissues was obtained in 30 patients of gastric carcinoma.Total RNA was extracted from these tissues,and reversely transcribed into cDNA by stem-loop technique.Real-time fluorescence quota PCR was used to determine miRNA-449b expression in the tissues.Results: Expression of miRNA-449b was down-regulated in 23 cases (76.67%) and up-regulated in 7 (23.33%).The expression level was generally lower than that of the adjacent tissues(t=2.395,P=0.023,P<0.05).The miRNA-449b expression was down-regulated in 16 of 17 cases with lymph node metastasis (94.12%),and in 7 of 13 without metastasis(53.85%),which suggested significant difference by Chi-square test (P=0.025,P<0.05).Conclusion: miR-449b is associated with the development of gastric cancer and presence of lymph node metastasis.

【Key words】 gastric cancer;miRNA-449b；lymph node metastasis

胃癌具有较高的发病率和病死率，其预后很大程度上取决于疾病诊断时所处的阶段[1]。然而，目前没有良好的生物标志物能有效的早期诊断，因此探索新的生物标志物和更好地了解这些机制有着重要的临床意义。微小RNA(miRNA)是存在于真核细胞中具有进化保守性的一族非编码小片段RNA，大约18～25个核苷酸大小，通过与靶基因mRNA 3-′非翻译区的碱基互补配对介导mRNA 的降解，或抑制其翻译降低基因的表达，实现对蛋白表达的调控[2]，控制着细胞的分化、增殖和程序性细胞死亡等多个重要生理过程[3]。miRNA表达谱的研究已经证明其在很多疾病包括常见癌症中表达失调[4]，并且可能扮演着致癌基因或抑癌基因的角色[5]。miRNA-449首次在胚胎鼠脑组织中发现[6]，位于细胞分裂周期20B (CDC20B)基因的第二个内含子，其家族由miRNA-449a、miRNA-449b和miRNA-449c三名成员组成。研究发现其在多种肿瘤细胞株和实体瘤中低表达，包括肝癌[7]、前列腺癌[8]、肺癌[9]、结肠癌[10]等，而在胃癌中的研究较少。本研究主要探讨miRNA-449在胃癌中的表达及其与淋巴结转移的关系，并通过生物信息学预测其可能的靶基因，以便进一步研究其在胃癌中的作用机制。

1材料与方法

1.1标本采集收集弋矶山医院2014年1～7月经病理确诊为原发性胃癌的患者手术切除标本，术前未经过放疗、化疗。取材时，分别取癌中央部位组织及距离肿瘤远端>5 cm的正常组织。取材后存放于无RNA酶的收集管中，再加10倍体积的样本保存液(RNAstore，TIANGEN公司)，确保完全浸没，1 h后转存-20°冰箱。采集的胃癌及癌旁组织标本共30对，患者的平均年龄(59.57±12.12)岁，经病理诊断均为腺癌；其中有淋巴结转移17例，无淋巴结转移13例；中分化标本5例，低分化标本25例。

1.2方法

1.2.1总RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen，美国 )一步法提取组织总RNA，按照产品说明书进行操作。提取后的总RNA用紫外分光光度计检测其浓度与纯度，将其终浓度调至1μg/μL，备用。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应( RT-qPCR )检测以U6为内参，设计特异性茎环引物(表1)，引物由上海捷瑞生物有限公司合成。逆转录反应采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒(Thermo)进行。反应体系与程序如下：总RNA1μL，特异性反转录引物1 μL(500 nmol/L)，补水至12 μL，在My Cycler TMPCR仪(BIO RAD)上65℃反应5 min，产物置于冰上3 min后加入5×Reacrion Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、RNasin(20 U/μL)1 μL、M-MLV(200 U/μL)1 μL，于PCR仪上42℃反应60 min，70℃反应5 min。得到的cDNA进行下一步荧光定量PCR反应。荧光定量PCR反应采用Maxima SYBR Green/ROX qPCR 试剂盒(Thermo)进行，体系25 μL，置于ABI step-one PCR 仪上50℃ 2 min、95℃ 10 min，后95℃15 s、60℃ 30 s、72℃30 s共40循环。熔解曲线分析设置在该循环结束时，以确保产物的特异性。以U6snRNA 作为内参，用2-△△CT法计算相对定量结果。miRNA-449b在癌组织与癌旁组织相对表达量的值大于1为上调，小于1为下调。

表1反转录和荧光定量PCR反应序列(5′→3′)

基因miRNA-449bU6反转录引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-CGGCAATTCAGTTGAGGCCAGCOligo(dT)15Primer特异性上游引物ACACTCCAGCTGGGAGGCAG-TGTATTGTTAGCTCGCTTCGGCAGCACA通用下游引物TGGTGTCGTGGAGTCGAACGCTTCACGAATTTGCGT

1.3统计学方法采用SPSS 18.0进行统计分析。RT-qPCR实验结果的数值经log2转化，所有数值均以均数±标准差的形式表示。采用配对样本t检验分析胃癌和癌旁组织中miRNA-449b表达水平的差异，采用Fisher 确切概率法分析miRNA-449b的表达与淋巴结转移之间的关系。设P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 RT-qPCR特异性表达产物的鉴定miRNA-449b与U6基因扩增出的目的片段大小分别为66 bp和94 bp，经2.5%的琼脂糖胶电泳结果显示条带单一无杂带，无引物二聚体(见图1)，结果显示miRNA-449b与U6基因的qPCR融解曲线只有一个主峰，重合性较好，可见引物特异性高且扩增时无基因组DNA污染(见图2、3)。

M:Mark，20 bp DNA Ladder，1～5泳道为miRNA-449 b，6～10泳道

为U6

图1miRNA-449b与U6基因扩增出的目标带

2.2miRNA-449b在胃癌中表达miRNA-449b在30例胃癌中相对于癌旁非肿瘤组织有23例(76.67%)表达下调，7例(23.33%)表达上调。miRNA-449b的相对表达水平：胃癌组为3.70±2.58，癌旁组为4.30±2.36，两者相比，miRNA-449b在胃癌中的表达低于癌旁组织，差异有统计学意义(0.60±0.25，配对t=2.395，P=0.023)。

2.3miRNA-449b与淋巴结转移的关系miRNA-449b在17例有淋巴结转移的样本中16例表达下调(94.12%)，13例无淋巴结转移的样本中只有7例表达下调(53.85%)，经Fisher 确切概率法分析，两组差异有统计学意义(P=0.025)。

3讨论

胃癌是常见的癌症之一，全球有超过70%的胃癌死亡病例发生在发展中国家，并且约50%的胃癌发生在东亚[11]。近几十年来胃癌的发病率和死亡人数在逐年增加，尽管胃癌发生的分子基础已被广泛研究，但其确切的分子机制目前仍不完全清楚。现有研究[1,11-12]发现多种miRNA参与胃癌的发生与发展。

miRNA-449是细胞凋亡、细胞周期停滞和(或)细胞分化的强效诱导剂[13]。他们同属于p53应答的miRNA-34 家族。但是，miRNA-449不受p53基因的调控，而受细胞周期调控转录因子E2F1的诱导[14]。这一家族的所有miRNA都能够介导细胞周期停滞和细胞凋亡，从而可能抑制肿瘤。其潜在的机制包括通过下调组蛋白乙酰基转移酶连续活化p53基因，引起细胞凋亡；靶向细胞周期蛋白依赖性激酶及其相关的基因，直接或间接抑制E2Fs因子的释放，促使细胞周期阻滞。有关miRNA-449在胃癌的研究中，Bou等[15]发现miRNA-449a/b在10例人类胃癌组织中8例表达降低，但未发现其表达与临床资料之间的关系，可能由于样本量较小；该实验显示miRNA-449a/b与靶基因结合，激活P53途径，进而诱导胃癌细胞凋亡，且进一步推测miRNA-449可能通过与细胞周期相关的靶基因结合下调E2F1的活性发挥其抑癌作用。

本研究中，我们发现miRNA-449b在30例胃癌组织中有23例表达下调，其平均表达水平低于癌旁组织，而且其表达与淋巴结转移相关，但其作用机制尚需进一步研究。根据生物信息学分析，目前在miR Tar Base上已经确定的miRNA-449b的靶基因有SIRT1、CCNE2、MET、GMNN、HDAC1、CDK4、 CDC25A和CDK6。在基因库中查询这些基因的主要功能是调节细胞凋亡、细胞周期以及生长与迁移。miRNA-449b在细胞周期中的调节作用研究较多[16-17]。Yan等[14]通过模型验证miRNA-449在调节细胞周期进程中起着至关重要的作用，并提供了双重的安全机制，通过细胞周期阻滞和凋亡以避免过多的E2F诱导的细胞增殖。最近有研究[15]发现miRNA-449可靶向生长因子及生长因子受体(MET)，调节生长、迁移与侵袭。Luo等[18]研究也表明miRNA-449a是在非小细胞肺癌中表达下调并通过靶向c-Met抑制人肿瘤细胞的迁移和侵袭。根据以上研究结果我们推测miRNA-449b在胃癌中表达失调不仅导致细胞周期蛋白控制的失调，也使生长因子和它们的受体表达失调，从而参与肿瘤的侵袭与转移。

虽然精确的分子机制还需要进一步的研究，miRNA-449b为胃癌患者的诊断和治疗提供了新的见解与策略。以前的研究主要集中在miRNA-449b在细胞周期中的调节作用，在本研究中，我们发现miRNA-449b的低表达与淋巴结转移的关系。这些数据表明，作为一种潜在的肿瘤抑制基因，miRNA-449b在胃癌的转移方面发挥着一定的作用，为胃癌的诊断与治疗提供新的思路。

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