胆囊胆固醇结石的形成与肝脏核受体基因表达水平的相关性研究

高广勇 马云明 岑建农

（1.苏州工业园区娄葑医院普外科 江苏 苏州 215000；2.江苏省血液研究所 江苏 苏州 215000）

核受体（Nuclear Receptors）是编码转录因子的一个超基因家族，在调节人体内多种生理活动中起到重要的作用。肝脏X受体(liver X receptor,LXR)和胆汁酸受体(Farnesoid X receptor,FXR)属于核受体超基因家族[1]。有研究发现，LXR和FXR在进行胆汁酸-胆固醇代谢的过程中具有重要的调节作用。为了探讨胆囊胆固醇结石的形成与肝脏核受体基因表达水平的相关性，我们对近年来我院收治的18例胆囊胆固醇结石患者和同时在我院接受肝脏血管瘤切除术且未患有胆结石的13 例患者的临床资料进行回顾性研究。现将研究结果报告如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究的对象为近年来我院收治的18例胆囊胆固醇结石患者和同时在我院接受肝脏血管瘤切除术且未患有胆结石的13例患者。将18例胆囊胆固 醇结石患者作为实验组，将接受肝脏血管瘤切除术且未患有胆结石的13 例患者作为对照组。在实验组患者中，有男性患者6 例，女性患者12 例。他们的平均年龄为（39.44±5.61）岁。他们均接受了胆囊切除术，经术后病理检查均被确诊患有胆固醇结石。在对照组患者中，有男性患者5 例，女性患者8 例。他们的平均年龄为（37.77±5.21）岁。他们均因患有肝脏血管瘤而接受了肝脏血管瘤切除术。他们经术前影像学检查及术中探查均被确诊未患有胆结石。两组患者在性别、年龄等一般资料方面相比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 检测方法

1.2.1 进行总RNA提取和合成cDNA 在对两组患者进行相关的手术后，在其肝脏的边缘切取其肝组织。切取肝组织的体积约为0.5 g。将切取下来的肝脏组织立即置于液氮中进行冻存，再将其转移至－70℃的冰箱中进行保存以备用。使用TRIzol （由INVITROGEN公司生产）的试剂对患者切取下来的肝脏组织中的总RNA进行提取。在使用DEPC-H2O 将总 RNA 稀释到 0.5μg/μl后， 采用 M-MVL逆转录酶（由PROMEGA公司生产）试剂合成cDNA。

1.2.2 进行实时定量PCR 进行实时定量PCR检测使用的引物是由Primer Express 软件5.0（由美国Applied Biosystem公司生产）所设计的，并由上海生工公司进行合成。PCR反应体系包含：cDNA为200 ng， Eavgreen为1 μl，引物的浓度为200pM,在加入双蒸水后使引物的体积达到25 μl。对样品进行3个重复的PCR反应。使用定量PCR仪（由MJ公司生产）对样品进行PCR 反应。进行PCR 反应的条件是:当温度达到95℃5 min后对样品进行50个循环，进行PCR 反应的阈值为0.05。进行每1个循环的过程是：在温度为95℃时进行变性反应20s。在温度为58℃时退火20s。在温度为72℃时进行延伸操作20秒，在温度为78℃时进行读板。在实时定量进行PCR反应检测结束后，使用熔解曲线对PCR 产物的特异性进行检验。 当熔解曲线的温度从60℃上至96℃的过程中，每上升0.2度进行一次读板。将PCR产物放置在琼脂糖凝胶电泳中，通过对PCR产物条带进行观察以检验PCR产物的特异性,并确定其不存在基因组DNA扩增的现象。由PCR反应的标准曲线获得Ct值，然后计算基因表达的相对量。采用GDPAH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）作为内参照。计算公式为：ΔC（t）=C（t）目的基因 -C(t)GDPAH， 基因表达的相对量 =2-ΔC（t）×10000。

1.3 统计学方法

使用SPSS 11.0统计学软件(由美国SPSS 公司生产)对本研究中的数据进行处理，计量资料用均数正负标准差（±s）表示,组间比较采用非参数检验（Mann-Whitney），P＜0.05表示组间差异具有统计学意义。

2 结果

实验组患者的LXRα、FXR和SHP等基因mRNA的表达水平均明显高于对照组患者，二者相比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。两组患者的 LXRβ基因及LRH-1基因 mRNA的表达水平相比较，差异无统计学意义（p＞0.05）。详情见表1。

表 1两组患者肝脏核受体基因mRNA表达水平的比较

3 讨论

LXR和FXR可通过调控靶基因的表达以维持脂类代谢的平衡。ABCB11和ABCB4都是FXR的靶基因[2]。ABCG5和ABCG8都是LXR的靶基因。有研究证实，ABCB11、ABCB4 、ABCG5和ABCG8的表达水平与胆结石的形成密切相关[3，4]。ABCG5和ABCG8[5]都是位于肝细胞胆管侧膜的转运蛋白，其在肝细胞分泌胆汁的过程中具有重要的调节作用。相关的研究结果显示，初级胆汁酸鹅脱氧胆酸(CDCA)和胆酸(CA)均可与FXR的LBD相结合，从而可调控靶基因的表达[6]。FXR被称为胆汁酸感受器，可维持胆汁酸内环境的稳定。FXR在胆汁酸代谢的过程中可通过3条途径发挥作用:①通过I-BABP（回肠脂肪酸结合蛋白）调控小肠对胆汁酸的摄取量。②通过调控ABCB11（BSEP蛋白）和ABCB4的表达，以促进胆汁酸和磷脂向胆道分泌。③通过调控CYP7A1的活性，以抑制胆固醇合成胆汁酸。CYP7A1是由胆固醇转化为胆汁酸途径中的限速酶。FXR需通过核受体SHP( short heterodimerpartner)和核受体LRH-1(liver receptor homolog-1) 对CYP7A1的活性进行调节[7]，从而调控胆汁酸的合成。

总之，胆囊胆固醇结石的形成与肝脏核受体基因mRNA的表达水平密切相关。因此，临床上可将上述指标作为胆囊胆固醇结石患者进行诊治的参考依据。

[1] 王水良.核受体的研究进展.遗传学报.2004；31：420－429

[2] 秦俭.核受体LXR和FXR对脂类代谢的调节. 国外医学外科学分册，2005；32：223－226

[3] 蒋兆彦，韩天权，所广军.胆固醇结石病人肝脏胆小管侧膜ATP基因表达差异的研究.外科理论与实践，2005;10（1）：61－65

[4] 高广勇，郭吕，岑建农.胆囊胆固醇性结石病人肝脏ABC基因表达研究.中华肝胆外科杂志，2008，14（4）：281－283

[5] Edwards PA, Kast HR, Anisfeld AM. BAREing it all: the ad option of LXR and F XR and their roles in lipid home ostasis.J Lipid Res, 2 0 02,4 3(1):2-12.

[6] Makishima M, Okamoto AY, Repa JJ, et al. Identification of a nuclear receptor for bile acids.S cience,1 999,2 84( 54 18) :1362-13 65 .

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