地丁豆根白术汤抗肿瘤作用的实验研究

辛明 王加众 刘卿 谭刘刚 赵孝民

[摘要] 目的 研究地丁豆根白术汤的抗肿瘤作用。 方法 用地丁豆根白术汤复方中药水提取物作用肿瘤细胞（sp2/0）和正常细胞（CEF）24 h，显微计数研究复方中药对肿瘤细胞的杀伤作用；流式细胞技术和AnnexinⅤ-FITC/PI探讨复方中药对肿瘤细胞的杀伤机制；腹腔注射sp2/0细胞建立小鼠同源腹水型肿瘤模型，灌胃给药，研究复方中药对发病小鼠的治疗作用。 结果 2.4 mg/mL的复方中药水提取物作用24 h后，可完全杀灭sp2/0细胞，而对CEF细胞无明显杀伤作用；2.4 mg/mL的复方中药可通过诱导细胞凋亡的方式杀伤肿瘤细胞，药物作用2 h时凋亡比率达到峰值（58.77%）；60 mg/d的药量能明显减少小鼠腹腔肿瘤的数量、大小，明显延长小鼠寿命。 结论 该复方中药对恶性肿瘤有一定的控制和治疗作用，可以作为治疗恶性肿瘤的药物做进一步研究。

[关键词] 地丁豆根白术汤；恶性肿瘤；凋亡；小鼠

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）33-0025-03

中药已经被用到多种癌症的治疗过程中，包括中药单体提取物[1]和复方中药[2]。这些中药在体外诱导肿瘤细胞凋亡和皮下抑瘤方面有一定的作用[3]，但少有实际应用上的报道，因而无法判断其在实际应用中的效果。深入考虑，当前对于中药治疗肿瘤的研究方法似乎存在一些不合理之处。因为人在自然条件下发生的类似于小鼠皮下的肿瘤[4]尚未见报道，长达24 h和48 h的中药体外作用时间[1]过长。我们知道口服中药4 h左右就会达到最高血液浓度并且半衰期出现在其后的1～3 h内[5]。因此，我们只有选取能在体外快速起效的药物，才有可能在治疗肿瘤的过程中有一个较好的效果。本研究使用辛同强医生组配的地丁豆根白术汤复方中药展开研究。首先选取一个适宜的药物浓度——在体外条件下，该浓度中药对肿瘤细胞（sp2/0）有明显的杀伤作用，而对正常细胞（CEF）生长情况影响较小。然后，通过流式细胞技术研究该药杀伤肿瘤细胞的机制。随后进行灌胃治疗小鼠腹腔肿瘤试验。

1 材料与方法

1.1材料

雄性BALB/C小鼠购自山东大学，sp2/0细胞和Hela细胞保存于本实验室，CEF细胞分离自SPF鸡胚，DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Gibco公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡试剂盒购自嘉美生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 所有的细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

1.2.2 中药提取物的制备 所有中药组分在去离子水中浸泡4 h，用电磁炉中火煎煮2 h。水提取物3000 r/min离心10 min，用0.22 μm直径的细菌滤器过滤，水浴蒸干水分，然后将提取物用无菌水溶解，调整浓度至30 mg/mL，并用0.22 μm直径的细菌滤器过滤除菌后保存于-20℃条件下备用。

1.2.3 细胞毒试验 处于对数生长期的CEF和sp2/0细胞，分别转移至24孔细胞培养板中培养，调整细胞浓度，使各孔的细胞量为5×104。培养6 h后用含有0 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL复方中药的DMEM培养液替换原先的细胞培养液，每个药物浓度设置四个重复组，其中0 mg/mL为对照。细胞继续培养24 h后，1000 r/min离心5 min，收集细胞，PBS重悬细胞后，用台盼蓝染色进行活细胞计数。结果用占对照组活细胞的百分比表示。

1.2.4 细胞凋亡试验 为进一步确定该复方中药杀伤细胞的机制，使用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡试剂盒对细胞的凋亡情况进行检测。将处于对数生长期的CEF细胞，转移至6孔细胞培养板中培养，调整细胞浓度，使各孔的细胞量为5×105。培养6 h后用含有0 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL复方中药的DMEM培养液替换原先的细胞培养液，每个药物浓度设置三个重复组，其中0 mg/mL为对照。继续培养2 h后，1000 r/min离心5 min收集细胞，用1×binding buffer调整细胞浓度为1×106个/mL，用FITC标记的Annexin Ⅴ避光染色5 min，随后PI避光染色5 min，立即用流式细胞仪测定细胞凋亡情况。根据CEF的细胞凋亡率选取最适药物浓度，然后以此浓度的药物分别作用于sp2/0细胞1 h、1.5 h、2 h、2.5 h测定肿瘤细胞凋亡的动态变化。

1.2.5 小鼠同源肿瘤模型的建立及治疗 12只五周龄的雄性BALB/C小鼠饲养于25℃条件下，采用自由取食取水的方式喂养。饲养1周后，每只小鼠腹腔注射5×106个处于对数生长期的sp2/0细胞，混合培养24 h后，将小鼠随机分成两组，每组6只，其中一组为对照组，一组为实验组。60 mg/d的中药提取物分3次通过灌胃的方式给予实验组的每只小鼠，时间间隔为6 h，对照组以同样的方式灌胃等量的生理盐水。待发病小鼠全部死亡7 d后，处死实验组未死亡小鼠。即时对两组死亡小鼠进行剖解，观察腹腔内肿瘤的大小、数量以及肿瘤所处的部位，同时记录死亡小鼠的死亡时间。

1.2.6 Hela细胞的细胞毒试验 为了进一步确定该复方中药对人肿瘤细胞是否具有杀伤作用，我们选用Hela细胞进行相关试验。采用不同浓度的复方中药作用于Hela细胞24 h后，进行活细胞计数。

1.3 统计学处理

采用SPSS20.0统计学软件作分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组各单变量比较采用独立样本t检验或方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1复方中药提取物对CEF和sp2/0细胞的细胞毒作用

两种细胞在含有不同浓度中药提取物的DMEM中培养24 h。其中sp2/0细胞在2.4 mg/mL和4.8 mg/mL药物浓度时全部死亡，而CEF的半数致死浓度为4.2 mg/mL，见图1。封三图1A和封三图1B分别展示的是2.4 mg/mL药物浓度下sp2/0和CEF的细胞形态，sp2/0的细胞形态明显变差，而CEF几乎没有变化。两种细胞平均存活率见表1，对于sp2/0细胞，各药物浓度之间均有显著差异，CEF细胞除4.8 mg/mL浓度外，其余浓度之间无明显差异；在同一药物浓度下CEF和sp2/0细胞间差异均有高度统计学意义（P<0.01），说明该复方中药具有明显抗癌作用的同时也仅有较小的毒副作用。

2.2 细胞凋亡分析

CEF细胞在0 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL的凋亡率分别为3.71%、4.09%、4.01%、13.29%（图2）。根据CEF的细胞毒作用和凋亡分析，我们最终选用2.4 mg/mL的药物浓度分别作用于sp2/0细胞1 h、1.5 h、2 h、2.5 h研究sp2/0细胞凋亡率的动态变化。sp2/0的凋亡率随着时间的延长有一个先上升后下降的趋势，峰值出现在2 h位点上，凋亡率为58.77%。该结果表明，本复方中药确可通过诱导肿瘤细胞凋亡的方式杀伤肿瘤细胞（封三图2）。

2.3动物试验

我们通过腹腔注射sp2/0细胞的方式，建立小鼠同源肿瘤模型。对照组小鼠中，肿瘤出现于接种sp2/0后的12～14 d，小鼠的死亡时间也集中在19～21 d，腹腔中有溶血性腹水，肿瘤分布在肝脏、胃、肠等器官的表面及内脏器官之间。然而，实验组的6只小鼠中有2只未发现肿瘤，其余4只发病小鼠的发病时间推迟到24～28 d，肿瘤分布于小鼠腹腔内皮下，最终死亡时间也推迟到35～38 d。此外，对照组的大型肿瘤数量平均每只小鼠5.2个，小型肿瘤的数量难以数清，而实验组的发病小鼠除了平均每只小鼠1.25个的大型肿瘤外，没有发现小型肿瘤。图3中可以看出对照组和实验组发病小鼠腹腔内肿瘤的数量及大小。

2.4 复方中药提取物对Hela细胞的细胞毒作用

随着药物浓度的提高，Hela细胞的存活率明显下降，表明该药对人体肿瘤细胞仍然具有较强的杀伤作用（封三图3）。

3 讨论

中医认为，人是一个有机整体，肿瘤是全身疾病的局部表现，它的发生、发展、转移等都是人体正气不足所致[6]，而肿瘤的病因主要是正气虚损、气滞血瘀、热毒积聚、痰凝湿阻[7]。地丁豆根白术汤遵循“治病求本”[8]的原则，全方功效：健脾益气，活血行气、祛瘀止痛、清热解毒、燥湿化痰、消肿散结。方中，白术等健脾益气；川芎、丹参活血行气，祛瘀止痛；蒲公英、山豆根、白花蛇舌草清热解毒，消肿散结；茯苓、天南星等燥湿化痰，利水渗湿[9]。

本研究首次选用快速起效的研究思路，通过体外、体内及人体试验对该复方中药治疗恶性肿瘤的效果进行综合评价。在体外，我们选用不同浓度的药物分别作用于正常细胞CEF和小鼠骨髓瘤细胞sp2/0，sp2/0细胞在药物浓度达到2.4 mg/mL时即全部死亡，而CEF在这一药物浓度下无明显的变化。在机制方面，考虑到口服中药在体内的代谢时间，我们首先用不同浓度的复方中药提取物作用CEF细胞2 h，然后根据CEF的凋亡率及sp2/0细胞在前一试验的存活率，最终选定2.4 mg/mL为研究sp2/0细胞死亡机制的最适浓度。为了获得肿瘤细胞凋亡率的动态变化，我们选用给药后不同的时间点对sp2/0细胞的凋亡率进行测定。凋亡率随着时间的延长有先上升后下降的趋势，峰值出现在2 h处，为58.77%。凋亡率下降的原因可能是，晚期凋亡的细胞形成凋亡小体，因此这部分细胞在流式细胞仪上不能够被检测出来。这一结论可以在封三图2中得到证实，在2.5 h时间点上的被检测细胞总数明显低于对照组，而这部分细胞可能是形成凋亡小体的晚期凋亡细胞。这一结论也与Nancy1998年在《Science》上发表的研究成果相一致，即细胞凋亡从开始到形成凋亡小体被吞噬细胞吞噬的整个过程是在30～60 min内完成[10]。我们也由此得出该复方中药可以通过诱导细胞凋亡的方式杀伤肿瘤细胞。

在体内，出于对癌细胞是自身细胞的变异，虽然跟正常细胞存在差异，但同时也与正常细胞有很多相似之处，以及原发性肿瘤大部分位于内脏器官表面或内部而并非位于皮下等诸多方面的考虑，我们最终选择腹腔注射sp2/0细胞的方式建立BALB/C小鼠的同源肿瘤模型。在我们的研究中，相对于对照组小鼠，实验组小鼠经过治疗后肿瘤细胞的数量明显降低，其中2只小鼠未发现肿瘤。结果提示，该复方中药能抑制肿瘤的形成与生长。为了探究复方中药对人肿瘤细胞的作用，我们开展了该药对Hela细胞的细胞毒试验，同时该复方中药对人肿瘤细胞的杀伤作用亦得已证实。

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（收稿日期：2015-09-07）