结核菌特异性Elispot检测IFN—γ对肺结核病诊断及其治疗的指导意义

李永兴 陶学芳 尉理梁

[摘要] 目的 探讨结核菌特异性Elispot检测IFN-γ对肺结核病诊断及其治疗的指导意义。 方法 选择我院2011年1月～2014年12月收治的肺结核患者100例，所有患者入组期间均采用住院观察，并持续住院时间均在3 d以上，先行Elispot检测，1 d后行PPD实验，比较确诊患者Elispot检测结果与PPD实验结果、Elispot检测阳性与阴性结果中斑点形成细胞数与Elispot检测卡介苗接种前后IFN-γ分泌水平。 结果 卡介苗接种前后IFN-γ分泌中ESAT-6水平和PoolA水平差异无统计学意义（P>0.05），Elispot检测阳性结果中斑点形成细胞数显著多于阴性（P<0.05），Elispot检测法的阳性率为88.0%，灵敏度为90.5%，特异度为19.2%，PPD实验的阳性率为74.0%，灵敏度为76.1%，特异度为41.7%，Elispot检测法阳性率和灵敏度均高于PPD实验（P<0.05）。 结论 结核菌特异性IFN-γ Elispot检测对于筛查肺结核感染患者具有明显优势，其不受接种卡介苗与否的影响，其阳性率和敏感性均显著高于常规PPD试验。

[关键词] 结核菌特异性；Elispot检测；IFN-γ；肺结核

[中图分类号] R52 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）33-0021-04

研究显示，我国人群中被结核菌感染的比例在30%以上，而超过90%人群在结核菌感染后并不出现核感染的临床症状[1]。进入新世纪后，我国进行的结核病大样本普查发现，随着生活质量的改善和医疗水平的提高，结核感染率有所下降，但仍有接近50%的人群被结核所感染。也就是说，健康人群中存在大量的结核杆菌潜伏感染者，加上感染后发病者，我国结核病疫情已较为严重[2]。目前针对该部分结核感染初诊上最主要的方法是结核菌素试验（也称为芒图试验、PPD试验），该试验中许多患者虽然PPD试验阳性，但仍无临床症状，处于潜伏期，所以PPD试验在临床中对于区分真正结核感染者效果有限[3]。本研究主要探讨结核菌特异性Elispot检测IFN-γ对活动性肺结核病诊断及其治疗效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2011年1月～2014年12月收治的肺结核患者100例，所有患者均符合以下诊断标准：①具有典型的肺结核临床症状或胸部X射线检查明确的肺结核病灶；②痰液或支气管灌洗液涂片行抗酸染色结果阳性；③痰液或支气管灌洗液测定结核分枝杆菌体外培养结果阳性；④痰内聚合反应发现结核分枝杆菌DNA片段；⑤芒图试验强阳性，患者体内存在血清抗结核抗体且检查结果为阳性；⑥排除非结核性肺部疾病；⑦规律抗结核治疗患者临床症状、实验室检查、影像学检查均得到改善。符合①与⑦以及②～⑥中两项以上者。其中男46例，女54例，年龄18～50岁，平均（42.3±2.1）岁，肺结核病程1～20年，平均（6.3±1.2）年，肺结核类型：原发性肺结核（Ⅰ型）者19例，血行播散型肺结核（Ⅱ型）者26例，继发型肺结核（Ⅲ型）者55例。

1.2 实验方法

1.2.1 结核菌特异性 IFN-γ体外检测 收集通过乙二胺四乙酸进行抗凝后的晨起患者肘静脉血5 mL，使用Ficoll法对外周淋巴细胞进行分离，并采用Elispot法进行检测。所有患者于采血后2 h内对标本进行外周血单个核细胞分离。对分离细胞活化后将其包被于抗体平板上，每孔注入100 μL，保持每孔的细胞浓度达到2×105个以上，之后加入结核菌重组蛋白抗原（ESAT-6）、PoolA及卡介苗，保持终浓度为5 μg每孔。随后盖上板盖，放置于37℃、5%二氧化碳温箱培养持续24 h。之后进行洗板，并加入待检测抗体，37℃条件下孵化1 h，再次洗板并加入亲和素孵化1 h。最后添加显色剂进行显色后最后洗板，计数Elispot斑点及其参数，以上所有操作均由具有5年以上工作经验的同一实验师严格按照说明书进行。采用酶联免疫斑点读板仪对斑点形成细胞数进行自动检测。结果判断：阳性：质控孔内斑点形成细胞数遍布整个反应孔，阴性为质控孔内存在5个以内斑点形成细胞数。

1.2.2 PPD试验 每例患者均使用2个国际结核菌素单位，约0.1 mL由同一护士选择患者前臂内侧皮肤进行皮内注射，持续观察15 min后可自行活动，于3 d后观察结果，详细记录硬结的直径，质地、颜色、有无红肿破溃等。

1.2.3 卡介苗接种 选择患者左上臂三角肌外侧下缘进行卡介苗的皮内注射，剂量为0.1 mL，所含菌量为0.5～0.75 mg。

1.2.4 主要试剂 Elispot试剂由北京大学医学部生物实验中心研制，结核菌素由成都生物制品研究所提供，包被抗体和检测抗体均由eBioscience公司生产，酶联二抗由PierceBiotechonology公司生产，结核菌重组蛋白抗原（ESAT-6）由本院检验科制备，卡介苗由上海生物制品研究所提供。

1.3 观察指标

对所有患者入组前均签署知情同意书，并申报医院伦理委员会批准，根据入组标准确诊后抽取患者肘静脉血5 mL备用，所有患者入组期间均采用住院观察，并持续住院时间均在3 d以上，比较确诊患者Elispot检测结果与PPD实验结果，Elispot检测阳性与阴性结果中斑点形成细胞数与Elispot检测卡介苗接种前后IFN-γ分泌水平。所有患者均先进行Elispot检测，1 d后行PPD实验。灵敏度=真阳性人数/（真阳性人数+假阴性人数）×100%，特异度=真阴性人数/（真阴性人数+假阳性人数）×100%。

1.4 统计学处理

应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，四格表资料采用四格表χ2检验，率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Elispot检测卡介苗接种前后IFN-γ分泌水平

卡介苗接种前后IFN-γ分泌中ESAT -6水平和PoolA水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 Elispot检测阳性与阴性结果中斑点形成细胞数及比较

Elispot检测阳性结果中斑点形成细胞数显著多于阴性，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 100例确诊患者Elispot检测结果与PPD实验结果比较

Elispot检测法的阳性率为88.0%（88/100），灵敏度为90.5%（67/74），特异度为19.2%（5/26），PPD实验的阳性率为74.0%（74/100），灵敏度为76.1%（67/88），特异度为41.7%（5/12），Elispot检测法阳性率和灵敏度均高于PPD实验，两种检查方法差异有统计学意义（χ2=4.811，P=0.026）。见表3。

3 讨论

我国属于发展中国家，结核菌感染是一种严重危害人群生命健康的公共卫生问题[4]，是国家卫生工作不容忽视重点需要防控的传染性疾病[5]。如何更有效地对结核病患者进行早期的诊断、筛查以指导治疗是防治结核病的重要手段[6]。其中结核菌素试验作为目前临床上唯一用于检测结核潜伏感染的方法，因其敏感性偏低，且存在加大的假阳性率而不被临床看好[7]。

目前使用IFN-γ检测代替PPD试验是研究热点，早在2005年，美国疾病控制及预防中心就已明确酶联免疫斑点法（Elispot）检测IFN-γ的临床价值，并规定其应用范围，尤其是针对移民人群、医务工作者、有结核感觉密切接触史者[8]。作为结核病诊断及治疗后效果评估中的主要细胞免疫学检测手段[9]。其有效结合细胞培养技术与酶联免疫吸附技术两者之长处，有效分析特异性抗原活化后的分泌型细胞因子，尤其是IFN-γ单个效应细胞的频数，从而更敏感的特异性鉴定结核杆菌。Elispot检测是通过再次刺激转导的同种抗原引起的致敏反应，促使记忆性T淋巴细胞释放IFN-γ，被认为是记忆性T淋巴细胞近期内暴露于结核抗原的有效指标[10]。肺结核患者免疫发病机制主要因T淋巴细胞介导细胞免疫改变所致。多数学者认为疫苗接种后所诱导的抗原特异性多功能T淋巴细胞可显著控制结核分枝杆菌感染及患者的病情[11]。尤其是Th1类细胞因子，如IFN-γ发挥十分重要的临床作用[12]。IFN-γ可反映T淋巴细胞的功能，其所产生非细胞损伤性病毒清除细胞因子在结核病患者的免疫应答中发挥积极作用[13]。另外，酶联免疫斑点技术则是上世纪80年代应用于实践，通过单细胞水平检测特异性抗体所分泌细胞及特异性细胞因子分泌细胞的免疫技术，其稳定性强、敏感性和特异性均较高[14]。近年来已将其应用于免疫系统疾病的检测，其中针对结核病患者机体免疫功能的测定，以更好地指导临床治疗而受到临床重视。有研究称[15]，与以往常用的PPD试验比较，结核菌抗原特异性IFN-γ水平检测具有两大优势，其一，具有较高的敏感性与特异性，而且不受接种卡介苗与否的影响[16]；其二，该实验可一次实验即得结果，无需受试者多次来院进行结果的判断，减少了患者不必要的麻烦[17]。

本组对患者进行Elispot检测与PPD实验，发现Elispot检测法阳性率和灵敏度均高于PPD实验（P<0.05）。PPD试验属于机体对结核菌素纯蛋白衍化物发生的一种迟发性变态反应，其主要的缺点为PPD可能混杂有除结核分枝杆菌外的非结核分枝杆菌等多种抗原[18]。尤其是PPD实验对于接种卡介苗后患者亦存在敏感性，患者将出现阳性反应，故进行PPD试验者除受结核分枝杆菌感染外还有可能是因接种卡介苗所致。而Elispot检测则是利用多种混合性特异抗原多肽[19]，其中关键是ESAT-6和PoolA为主的混合抗原，临床应用特异性显著优于PPD试验。

本组选择ESAT-6和PoolA抗原进行研究，无论接种卡介苗与否，其ESAT-6和PoolA抗原水平差异无统计学意义（P>0.05），可认为以上两种抗原多肽所诱导的IFN-γ水平变化不受接种卡介苗与否的影响，证实Elispot检测IFN-γ水平可有效避免接种卡介苗对其影响。针对100例Elispot检测患者而言，其阳性结果中斑点形成细胞数显著多于阴性（P<0.05）。虽然所有患者均确诊患有肺结核，但因结核蛋白来源不同，其长度与氨基酸排列顺序存在差异，故阳性患者斑点形成细胞数多于阴性者。而且针对规律治疗患者，治疗前其IFN-γ分泌水平一般较高，随者治疗的进行以及患者病情的好转，IFN-γ分泌水平逐渐下降[20]。

综上所述，结核菌特异性IFN-γ Elispot检测对于筛查肺结核感染患者具有明显优势，其不受接种卡介苗与否的影响，其阳性率和敏感性均显著高于常规PPD试验。

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（收稿日期：2015-07-17）