奥沙利铂联合替尼泊苷对胃癌HGC 细胞上Livin 蛋白影响的实验研究

张 鹏，潘 颖，高 悦

1.北京市石景山医院药剂科，北京100049;2.河北医科大学第三医院药剂科

胃癌是目前较为常见的肿瘤，具有发病率高、恶性程度高的特点。由于早期诊断较为困难，发现时多为晚期，失去手术机会，所以化疗成为主要治疗手段。目前研究表明［1］，奥沙利铂(Oxaliplatin，OXA)对胃癌具有较好疗效。广泛用于小细胞肺癌的替尼泊苷［2］(Teniposide，VM26)，对控制胃癌的发生、发展也有一定效果。Livin 蛋白［3-4］是近年来发现的癌症抑制因子，该蛋白可作为胃癌分子标志物之一，在胃癌组织中表达量增高，如在胃癌发展过程中表达减少，则可说明癌细胞得到控制［5］。本实验采用较为常见的胃癌HGC 细胞为研究对象，观察两种化疗药物使用后对Livin 蛋白表达的影响，旨在为临床化疗方案的选择提供实验依据并探究相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 胃癌HGC 细胞株购自中国科学院肿瘤医院中心细胞库(北京)，PMI 1640 培养基购自北京鼎国(CC0031);胎牛血清购自 Hyclone(SH30084.03);Anti-Livin 购自Abcam;DAB 显色试剂盒购自北京鼎国(AR1022);RIPA 裂解液购自北京鼎国(WB0071)。凝胶成像分析仪及电转仪购自Bio-Rad;PCR 仪购自ABI(9700)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组处理:细胞用10%胎牛血清培养，接种密度为5 ×105/ml，于25 ml 培养瓶中培养。放置在含5% CO2，37 ℃饱和湿度的培养箱中保存，胰蛋白酶消化，传代，实验用细胞均处于对数生长期。空白对照组用10% 胎牛血清培养，不用药培育48 h;OXA 组在空白对照组基础上，予浓度为1.25 g/ml OXA 0.5 ml 培育48 h;VM26 组在空白对照组基础上，予浓度为1.25 g/ml VM26 0.5 ml 培育48 h;联合组在空白对照组基础上，予浓度为1.25 g/ml OXA 0.25 ml 及浓度为1.25 g/ml VM26 0.25 ml 培育48 h;取细胞备用。

1.2.2 免疫细胞化学法检测蛋白表达:细胞用药48 h后，用5%多聚甲醛固定30 min，滴加5%山羊血清封闭液，室温20 min。滴加稀释倍数为1∶250 的兔抗鼠Livin 抗体，4 ℃过夜。PBS 洗2 min ×3 次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃20 min。PBS 洗2 min ×3次。滴加试剂SABC，37 ℃20 min。PBS 洗5 min ×4次。使用DAB 显色试剂盒显色，按试剂盒说明操作后，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，封片，显微镜下观察，拍照。用Image-pro plus 5.0 分析计算光密度值。1.2.3 RT-PCR 检测基因表达:按照试剂盒说明书采用Trizol 一步法，提取总RNA，逆转录成cDNA。Livin引物序列:上游引物5＇-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3＇，下游引物5＇-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3＇;内参序列:上游引物5＇-AGCGCAAGTACTCCGTGTG-3＇，下游引物5＇-AAGCAATGCTATCACCTCCC-3＇;25 μl 反应体系，预变性94 ℃1 min，退火60 ℃1 min，延伸72 ℃2 min，循环35 次。余按试剂盒说明进行操作，用反应产物的吸光度与内参的比值表示该基因表达强度。

1.3 统计学分析 采用SPSS 10.3 软件进行2 ×2 析因设计方差分析，计量资料用±s 表示，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫细胞化学法检测蛋白表达 免疫组化图片显示，Livin 蛋白多表达在胞浆中，结果显示差异有统计学意义(P ＜0.05，见图1 ～2)。与空白对照组相比，OXA 组、VM26 组及联合组肿瘤组织内Livin 蛋白表达减少(P ＜0.05)，且两种药物作用效果具有交互作用(P ＜0.05)。

图1 不同组中Livin 蛋白阳性表达情况(200 ×) A:空白对照组;B:OXA 组;C:VM26 组;D:联合组Fig 1 Livin positive product in each group (200 ×) A:blank control group;B:OXA group;C:VM26 group;D:OXA combined with VM26 group

图2 不同组中Livin 蛋白表达光密度值Fig 2 Optical density value of Livin positive product

2.2 RT-PCR 检测基因表达 采用RT-PCR 方法检测Livin mRNA 表达，统计学交互性分析结果显示，差异有统计学意义(P ＜0. 05)。与空白对照组相比，OXA 组、VM26 组及联合组肿瘤组织内Livin mRNA 表达减少(P ＜0.05)，且两种药物作用效果具有交互作用(P ＜0.05，见图3)。

图3 不同组中Livin mRNA 相对表达量Fig 3 The relative expression of Livin mRNA

3 讨论

胃癌是一种常见病、多发病，严重危害人类健康，影响生活质量。有研究［6-8］表明，胃癌的发生是多层次、有序化过程，引起正常胃黏膜导致癌变的机制，可能与抑癌基因表达减弱、癌基因表达增强有关。Livin蛋白［9-10］是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成员，与胃癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤发生密切相关，成为肿瘤治疗的新靶点，引起广泛重视。该蛋白［11-12］通过同Caspases 结合，抑制Caspases活性，阻断凋亡途径，引起凋亡障碍，导致肿瘤的发生和发展。Tu［13］研究表明，Livin 基因表达同胃癌患者的预后及生存率存在相关性。Wang 等［14］通过试验证实，Livin 蛋白表达减少的肿瘤患者预后较好，生存期较蛋白表达变化不大的患者长。Zhao 等［15］通过基因沉默技术发现Livin 基因同肿瘤恶性程度具有相关性。

本实验采用较为常见的胃癌HGC 细胞为研究对象，观察两种化疗药物使用后对Livin 蛋白及基因表达的影响，旨在为临床化疗方案的选择提供实验依据并探究相关机制。研究结果显示，在蛋白层面上，同空白对照组相比，OXA 组、VM26 组及联合组肿瘤组织内Livin 蛋白表达减少，说明OXA 和VM26 这两种因素都可以抑制Livin 蛋白的表达，且2 种因素之间存在交互作用，在基因层面上，RT-PCR 结果显示与蛋白结论吻合，说明该蛋白表达减少可能是通过下调mRNA 实现的，且OXA 和VM26 都可以下调Livin 基因表达，且两种因素之间存在交互作用。本研究结论，同马望等［16］的研究结论具有一致性，为研究OXA 和VM26治疗胃癌提供实验依据，具体机制仍有待进一步增加体内试验研究。

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